叶绿素的定量测定及叶绿素荧光仪分析
实验原理
叶绿素的定量测定：叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663nm与645nm，又，根据光密度的加和性我们可以在这两个波长的光下分别测叶绿素提取液的消光度并根据其不同情况的比吸收系数来计算叶绿素a、b各自的含量。

另外，由于叶绿素a、b在652nm 波长光照下有相同比吸收系数34.5，故可测出总叶绿素含量。

叶绿素荧光仪参数分析：接受了1个光子的激发态的叶绿素有三种途径来回到基态，分别为荧光、光化学反应和热。

因此测量叶绿素荧光动力参数可以反映植物光合作用的状态（光能的吸收、转运及分配等）。

叶绿素荧光仪可分为连续激发式与脉冲调制式，本次试验用的是脉冲调制式，有便携的特点。

已知植物荧光多来自PSII天线色素蛋白复合体中的叶绿素a，荧光发射波长范围约在650-780nm，发射峰在685nm与735nm。

当植物经过暗适应后，所有的PSII都处于完全打开状态，即其下游PQ等都处于氧化状态，PSII系统可以接受电子。

此时经过激发光照射后所发射的荧光是固定荧光F0。

之后用饱和脉冲技术，即用一个持续时间很短的强光关闭所有光合作用电子门使PSII的光化学作用暂时无法进行，再测量荧光，可得最大值F m（此时光合作用能量全部转化为荧光和热）。

F v为可变荧光，为F m与F0之差，反应了QA的还原情况。

实验仪器及材料
脉冲调制式叶绿素荧光仪，分光光度计，研钵，漏斗，分析天平。

菠菜叶，80%丙酮，碳酸钙，石英砂，不同环境下的烟草。

实验步骤
1.叶绿素定量测定
1.称取新鲜菠菜叶片5g剪碎置于研钵中，加入适量碳酸钙与石英砂和适量丙酮，匀浆，
继续加入适量丙酮碾磨充分，用丙酮过滤于带刻度试管内，定容至25ml，摇匀。

2.以80%丙酮为参比液，分别在645nm、663nm与652nm波长光照射下测量吸光度。

3.处理数据。

2.叶绿素荧光仪参数分析
1.选取一盆从温室移至室内条件下的烟草植株与一盆室内条件（逆境）处理的烟草植
株，分别在相似位置夹上叶片夹子，暗适应20min。

2.用叶绿素荧光仪在F v/F m档测量叶片荧光参数。

3.数据分析。

实验结果
1.原始数据记录
1.叶绿素定量测定
表1.稀释1倍后的提取液OD值测量
表2.稀释2倍后提取液OD值测量
2.叶绿素荧光仪参数分析
表3.荧光参数第一组
表4.荧光参数第二组（同组人测量）
2.数据处理及分析
1.叶绿素定量测定
由于稀释一倍时有测量数据超出量程，故改为稀释两倍。

已知叶绿素a、b 80%丙酮溶液最大吸收峰在663nm下分别为82.04与9.27,645nm下分别为16.75与45.6，可列出关系式：
D663=82.04C a+9.27b
D645=16.75C a+45.6b
代入稀释两倍后的数据，解得C a`=5.08mg/l ,C b`=2.31mg/l
故原提取液内C a=20.32mg/l ,C b=9.24mg/l 。

叶绿素总量为C T=29.56mg/l。

若用OD652求叶绿素总含量：
C T=D652∗1000
34.5
由稀释一倍的数据得源提取液叶绿素总浓度C T1=33.7mg/l
由稀释两倍的数据得源提取液叶绿素总浓度C T2=29.1mg/l
由C T、C T1和C T2算出的叶绿素含量分别为1.478mg/g、1.685 mg/g、1.455 mg/g。

2.叶绿素荧光仪参数分析
F0：在第一组数据中，F0正常>F0胁迫且差值为39.而第二组数据中F0正常与F0胁迫相差不大，有F0胁迫—F0正常=1。

F0为基础荧光，是在所有PSII都处于打开状态时，即都可以发生光反应时，收到适当激发光后发出的荧光。

是一个与叶绿素浓度有关的基础量。

因此可能与是否受短期胁迫关系不大，而与叶片本身生长状态有关。

F m：受胁迫的F m值明显小于不受胁迫的F m值。

F m1正常- F m1胁迫=283，F m2正常- F m2胁迫=379 。

F F m为所有PSII关闭时所测荧光，即此情况下PSII将本来要转化为传递电子的能量都作为荧光与热散发出。

因此F m可用来大致表示叶片接收的光能。

F v、F v/m、F v/0：F v=F m-F0，表示可变荧光，是在排除了固定荧光后所剩的光能，即可能用于光化学反应的最大能量。

F v可以反映叶绿素的活性。

由数据知胁迫条件下F v明显减小，可知在胁迫状态中光合作用系统受阻。

F v/m是PSII最大光化学量子产量，可反映PSII反应中心的最大光能转换效率。

分析数据知F v/m正常都稍稍大于F v/m胁迫，即正常植株的PSII最大前光能转换率稍大于受胁迫植株。

F v/0可表示PSII反应中心潜在活性。

由数据知正常植株的PSII潜在反应活性大于胁迫植株。

小结
思考题
叶绿素含量与荧光参数间的联系：
由于活体状态下叶绿素荧光几乎全部来源于PSII的叶绿素a及其天线色素的叶绿素a，因此PSII的变化可直接影起荧光变化。

而叶片内叶绿素的含量将影响PSII及其天线色素中叶绿素a的含量，可直接影响PSII，因此会对荧光参数产生影响。

叶绿素a含量减小将直接影响到F0与F m，但不一定会对F v/m、F v/0产生影响。

另外，叶绿素含量及比例可能会影响PSI等，间接影响PSII电子传递能力，从而影响F0及F v/m、F v/0等。