生化分离方法：离心、层析、电泳和膜分离等生化分析方法：重量法、化学法、分光光度法、酶法、色谱法生化制备方法：生物大分子制备的前处理、分离纯化、浓缩与干燥、超临界流体提取法、萃取与相分离、结晶、样品的保存生化分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。

1 离心技术1.1 基本原理离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。

应用：各种生物样品的分离和制备。

如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。

生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。

相对离心力离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。

RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。

1.2 离心分类根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类：差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法（rate zonal centrifugation）等密度离心法（isopycnic centrifugation）1.2.1 差速离心法利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

关键是选择适合于各分离物的离心力。

例如差速离心分离细胞组分1.2.2 速率区带离心法速率区带离心法是在离心前于离心管内先预装密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的顶部进行离心。

离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大；但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。

根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。

梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制。

如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有有足够的时间使在介质中分离形成区带。

由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。

常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例如，Percoll）及蔗糖。

离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。

离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。

沉降系数越大，沉降越快。

离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。

离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。

离心时间越长，区带越宽。

适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。

较长的离心管有助于提高分辨率。

1.2.3 等密度离心法等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。

等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯度），此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯度液混在一起。

在离心过程中由于样品各单一成份向自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。

等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。

当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。

沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。

体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。

但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。

此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。

常用的梯度液是CsCl。

1.2.4 梯度溶液的制备⑪梯度材料的选择原则理想梯度材料具备的特点：①化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分离的生物粒子分开②溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。

③不会对离心设备发生腐蚀作用。

④容易纯化，价格便宜或容易回收。

⑤较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料，浓度便于测定。

⑥物理性质、热力学性质应该是已知的。

但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完美梯度液。

基本符合原则的梯度材料：①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原②无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等④硅溶胶：如Percoll⑤蛋白质：如牛血清白蛋白⑥重水⑦非水溶性有机物：如氟代碳等⑫梯度材料的应用范围①蔗糖：水溶性大，性质稳定，其最高密度 1.33g/ml，价格低易制备。

但渗透压较高，高浓度时粘度较大。

线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V。

用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，以及较高的渗透性，不宜用于细胞的分离。

②聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400（相对分子重量400000），Ficoll渗透压低，而粘度特别高，与泛影葡胺混合可降低粘度。

用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

③CsCl：为离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。

由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。

④卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。

NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

⑤Percoll：商品名，是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，不穿透生物膜，对细胞无毒害，对生物材料的影响小，颗粒稳定。

在冷却和冻融情况下稳定，粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。

用于细胞、细胞器和病毒的分离。

蔗糖适宜做速率区带离心的材料，而等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。

密度梯度液可用梯度仪制备线性梯度，也可人工辅设阶梯型梯度，离心管静置一定时间后也可以形成近线性梯度。

阶梯型不连续梯度多适用于从组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。

连续梯度由于其密度平滑地变化，多用于某些生物样品的多种成份组合的分离。

选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。

如果些胶体硅材料（Percoll或Ludox）可在10000~20000g的离心场中离心30min就可以自形成梯度。

但CsCl或Meterizamide需要50000~500000g的离心场中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度.如用CsCl做质粒DNA分离，梯度液中加EB和Triton x-100，在490000g需要离心4hr，才能利用CsCl的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA和蛋白质。

预形成梯度的优点是离心时间较短，因为只要考虑样品中某个组份到达其等密度区所需要的时间。

预形成梯度常被用来分离较大颗粒，如>100S的样品。

预形成梯度缺点是被分离样品的容量较少；对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结，从而减少了样品回收率和纯度；预先制备样度液需较长时间，较繁复。

自形成梯度：某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度，Ludox、Percoll中的胶体硅颗粒可较快地形成梯度，而另一些材料如CsCl、Cs2SO4和Metrizamide等则在沉降过程中受到其反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就比较长。

如果为了提高分辨率，自形成梯度是很难使梯度曲线变得陡一些的。

1.3 离心设备离心机分为工业用和实验用离心机。

实验用离心机又分为制备性和分析性离心机。

制备性离心机主要用于分离各种生物材料和分子，分离的样品容量比较大。

分析性离心机一般都带有光学系统，用于研究生物大分子和颗粒的理化性质。

分析性离心机都是超速离心机。

1.3.1 离心机的种类普通离心机转速2000~6000rpm，RCF可达6000g；容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，转速控制不严格，一般无制冷系统，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。

普通离心机以交流电动机驱动，电机碳刷易磨损，利用电压调压器调节转速，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此必需进行精确平衡，以免损坏离心机。

高速离心机：转速20000~25000rpm，RCF可达89000g，最大容量可达3升，分离形式是固液沉降分离。

转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头。

一般有制冷系统，以消除转头与空气摩擦而产生的热量（温度0～40℃），转速、温度和时间都可严格准确地控制。

通常用于微生物菌体、大细胞器、蛋白质硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作。

超速离心机：转速50000~80000rpm，RCF可达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋白质和多糖等生物大分子的分离。

按性能可分为分析型、制备型和分析制备型三种。

超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。

驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变频感应电机驱动，由微机控制。

驱动轴较细，在旋转时有一定的弹性弯曲以适应转头轻度的不平衡。