摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。
关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学Abstract：Proteomics which is the new discipline in the time of the post-genomics develops rapidly in the life science．The present paper has documented the current situation and new development of the techniques of separation and identification in this area，including 2·dimensional gel- electro·phoresis，chromatography an d mass spectrometry．Key words：Proteomics；2-Dimensional gel electrophoresis；Chromatography；Mass spectrometry；Bioinformatics1、概念及相关内容随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究,并产生了一门新的学科———蛋白质组学(proteomics) 。
“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Wil2liams[ 1 ] 最早提出的,是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。
被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。
蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同,它着重于全面性和整体性,研究的对象不是单一或少数的蛋白质,而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究,包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。
蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者———蛋白质水平。
蛋白质组研究已成为后基因组时代的主要任务[ 2,3 ]。
2、蛋白质组研究的主要技术相对于基因组的研究,蛋白质组的研究相对滞后,主要原因是缺乏像基因组研究那样成熟的技术。
当前蛋白质组研究的主要技术可分为两大类,一类是蛋白质组的分离技术,包括双向电泳、双向高效柱层析等;另一类是蛋白质组的鉴定技术,包括质谱技术、生物信息技术等。
2.1 蛋白质组的分离技术2.11 双向凝胶电泳技术(2-DE)双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法之一。
这项技术是O′far2rell 、Klose 和Scheele 等[4 ,5 ]于1975发明的。
双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。
虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。
双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。
凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。
蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。
差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。
两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。
在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。
DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
2.12 双向高效柱层析其基本原理是先进行一次分子筛柱层析,按蛋白质分子量大小进行第一次分离,从柱上流出的蛋白峰自动进入第二向层析进一步分离,第二向层析通常是利用蛋白质表面疏水性质进行的反相柱层析。
和双向电泳相比,双向高效柱层析的优点是可以适当放大,分离得到较多的蛋白质以供鉴定;可以和质谱技术联用实现蛋白质分析技术的自动化,同时流出的蛋白峰直接进入质谱进行鉴定,可减少印迹的步骤和因此引起的缺点。
2．13 色谱分离技术近年来，色谱技术的发展为蛋白质和多肽或亚基的分离分析提供了新的手段。
色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之间不同的分配系数，使其在相对运动着的两相间经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。
按两相状态来分类，有气相色谱法(gas chrom- atography，GC)和液相色谱法(1iquid chromatography，LC)两种，而其中的LC是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。
单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。
多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特性的液相分离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。
此外，多维液相分离系统还具有快速、高通量、自动化、重复性好等优点[6]。
常见的多维液相分离系统有二维液相(two．Dimensio- nal liquid chromatography，2D—LC)、二维毛细管(two·dimensional capillary eleetrophoresis．2D—CE)、液相色谱一毛细管电泳(LC —CE)等。
色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。
如Opiteck等[7]。
首次报道多维色谱整合质谱技术(MS)分析蛋白质混合物，Washurn等[8]在多维LC—MS／MS的基础上，提出MudPIT(multidimensional protein identification technology)方法，成功分离和鉴定了酵母中1484种蛋白质，这其中还包括一些低丰度的调控性蛋白激酶。
Nielsen等[9]应用LC—MS／MS技术成功分离鉴定了海马组织中的1 685种蛋白质。
毛细管电泳(CE)作为一种最新的色谱分离技术，将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合，目前已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。
与经典电泳相比，CE由于其侧面截面积大，散热快，能克服由于焦耳热引起的谱带展宽，且可承受高电压，因此分离效率提高，柱效可达几百万乃至几千万理论塔板数／m以上[10]。
CE在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。
CE在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。
CE有很多灵敏的检测技术，如紫外检测、荧光检测、化学发光检测等。
应用于蛋白质组研究中的CE技术主要包括毛细管区带电泳(capilary zone electro—phoresis，CZE)、毛细管等电聚焦电泳(capilary iso．eletriefocusing，CIEF)、毛细管凝胶电泳(capilarygel eleetrophoresis，CGE)和胶束电动毛细管层析(mieelar eleetrokinetie eleetrophor- esis ehromatogra·phy，MECC)等。
2.14 同位素包被亲和标记（ICAT）ICAT是用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术，基本原理是将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准，与另一状态的蛋白混合物混合酶解，消化后的复杂多肽混合物通过亲和标签用生物素亲和层析柱将标记的多肽分离，最后分离的样品可以用LC-MC分析或用LC-MC/MC直接由蛋白序列信息来确定蛋白。
这一技术克服了2DGE的缺点，能全自动化，可以用于高通量蛋白质组"可以精确检测疏水的膜蛋白、PI和分子量偏大或偏小的蛋白，同时还能够测定其中蛋白质序列[11]使它的分析范围远大于2DEG。
有人用这一方法精确鉴定了体外和自然状态下分化的人HL60细胞微粒体片段中491个蛋白及其相对量，其中大部分是膜或膜相关蛋白。
ICAT在定量及差异表达检测上有巨大的优势，但也面临一些问题。
ICAT最大的挑战在于样品高度复杂，质谱分析获得数据的能力与这种复杂性相比显得不足。
但随着ICAT技术的不断进步与完善，它仍将是蛋白质组差异表达研究中的主要技术之一。
2.2蛋白质组鉴定技术2.21质谱技术其原理是对2DE所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。
质谱技术的发展解决了这一难题。
它需要三个步骤，首先通过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比（m/z）的不同进行分离，最后转化到离子检测装置[ 12 ]。
目前，用来分析蛋白质和肽的样品离子化技术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱(MALDI)和电子喷射离子化质谱(ESI)。
MALDI通常与飞行时间质谱(TOF)相结合。
TOF主要用来测量分析物飞过固定的路径所需的时间。
另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱(MS/MS)。
在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列的部分信息。
质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。
目前MS/MS是唯一能够迅速测序N 末端封闭或共价修饰肽段的方法[1 ]。
质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受[15]，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏[14]，在一些情况下，仅需10-15 fmol的蛋白[14,16,13], 这在只能得到极少量蛋白的情况下鉴别蛋白是很有用的。
在实际工作中可将几种技术结合应用，如串联质谱与Edeman微测序技术相结合[15]，MALDI质谱与纳米电子喷射质谱相结合，这些技术相互互补，为分析2DE所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。
2.22表面等离子共振技术(SPR)SPR是研究蛋白质相互作用的新技术，其原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表面电子发生等离子共振时反射光强度最小时的入射角SPR角[17]。