GSH+5,5’-DTNB
5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子
二硫对硝基苯甲酸
于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算 出GSH减少的量
分光光度法检测自由基清除能力 (DPPH)
• DPPH・是一种稳定的自由基,其醇溶液呈深紫色,在 517nm处有一吸收峰。
• 当反应系统中存在自由基清除剂时,它可以和DPPH・ 的单电子配对而使517nm处的吸收峰渐渐消退。
未成对电子
自由基在夺取正常分子的电 子后，该分子就变成另一个自 由基， 如此循环，就会引发连 续的氧化反应，最终对机体产 生重大影响！
自由基的产生与分类
机体生理活动产生
机体的新陈代谢需要由氧化反应产生的能量， 这些氧化反应就是自由基的重要来源。
内源性自由基的产生
➢自由基的分类 机体内的自由基主要分为氧自由基和
自由基的清除
• 机体内存在着一套内源性抗氧化防御系统 ，它可以维持体内自由基代谢的平衡，使 人体处于健康状态。
直接
•与产生反应性氧化物（ROS）所 必需的金属离子结合，从而抑制 ROS的生成。 •通过补充合成抗自由基酶的必需 元素，提高酶促系统的合成能力。
酶促系统
➢ 超氧化物歧化酶（SOD）歧化自由基O-2生成H2O2
亚硝基化合物 或氮氧化合物
NO
O-2·
·OH
血红蛋白
N-甲基葡萄糖胺-铁 复合物（MGD）
1，2-二羟基苯-3， 5-二磺酸钠(Tiron)
5, 5-二甲基1-吡咯 啉N-氧化物(DMPO)
• 总结
优点 可在室温下进行检测，解决了生理条件下
水溶液中寿命极其短暂的自由基的定性和 定量问题。 缺点 ➢有些自旋捕集剂对生物体有毒,有些易受到 血脑屏障限制,无法到达自由基生成的组织 部位; ➢被捕获的自由基不专一,而且ESR法难以清 晰的解释被捕获的自由基种类,需要待测自 由基的清除剂加以佐证; ➢仪器成本较高
分光光度法
• 基本原理 利用自由基使显色剂发生颜色变化 , 根据 吸光度的变化值而间接测得自由基的含量
• 应用 ·OH、O2-、NO、SOD、CAT、GSH-Px、自
由基清除能力的测定
分光光度法检测·OH
分光光度法检测O2-
分光光度法检测NO
分光光度法检测CAT
2H2O2 CAT 2H2O+O2 体系中残留的过氧化氢再与钼酸胺作用生成黄色复 合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定
325nm、 420nm
碱性
邻苯三酚
中间体A O2 中间体B H2O2 终产物
O2-
SOD
2O2-+2H+
O2+H2O2
分光光度法测GSH-Px
• 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）对防止体 内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其 活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位 时间内GSH减少的量来表示
GSH-Px
•高效液相色谱法（HPLC）
•自动电位滴定法
•极谱法
自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法
顺磁共振波谱仪示意图
• 生物体内能直接用ESR技术检测研究的自 由基很少，因为体内绝大多数自由基的反 应活性非常高，半衰期很短，使其浓度很 低（10-8M- 10-10M），不能达到目前ESR 技术的检测水平（10-6M -10-7M）
自由基的检测
主要内容
自由基简介 自由基及其性质 自由基的产生与分类 自由基与机体损伤 自由基的清除
自由基的检测方法
自由基及其性质
1.自由基（free radical）
化学上也称为“游离基”，是指带有不成对（ 奇数）电子的原子、原子基团或分子。
2.自由基，具有高度活泼性，很容易夺取其他物质
的电子而转变为稳定状态。在化学上，这种现象 称为“氧化”。
分光光度法检测SOD
1、细胞色素C还原法
SOD 歧化
黄嘌呤-黄嘌呤氧化 酶体系
氧化型细胞色素C O-2还原型细胞色素C
550nm
2、氯化硝基四唑氮蓝 （NBT）还原法
SOD 清除
NBT
O-2
二甲臜
560nm
反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高. 据此可以计算出酶活性大小
3、邻苯三酚自氧化法
脂质自由基
氧自由基包括超氧阴离子自由基O2-、羟自由基
• OH
脂质自由基（LPO）是细胞膜上的不饱和脂肪酸 被自由基夺去电子后所产生的。
氮中心自由基：一氧化氮（NO）、过氧亚硝基阴 离子（ONOO-） 等。
自由基与机体损伤
➢在受控情况下对机体是有益的,也是必需的 自由基是能量传递的搬运工。 自由基可以帮助杀灭细菌、病毒和寄生虫 ，还能参与排除毒素。 信使分子。
• 根据消退速度和峰值改变程度可了解反应系统中自由 基清除剂的反应速度和能力。
• 解决这一困难的重. + ST → R-SA•∗
自由基
自旋捕获剂 (一般为抗磁 性物质 )
自由基加合物 （radical adduct, 长寿命自由基）
使自由基加合物的浓度积累到能被ESR检 测到的水平
自由基捕获剂
通用自旋捕获剂
特异自旋捕获剂
*NO作为信使分子， 作用于平滑肌，使 血管扩张 硝酸甘油
➢ 自由基的危害
自由基过量，并失控时，机体的正常秩序就会被 破坏，并因此产生多种疾病。
➢自由基的损伤机理 1.损伤细胞膜结构 2.导致免疫系统功能紊 乱 3.损伤基因，导致DNA 变异
1.损伤细胞膜结构 自由基对细胞膜结构的损伤，主要是
自由基与细胞膜上丰富的不饱和脂肪酸反应， 形成脂质过氧化物（即LPO）而影响膜的正 常功能。
2O-2+2H+ SOD O2+H2O2
➢ H2O2可被过氧化氢酶（CAT）分解为H2O
2H2O2 CAT 2H2O+O2
➢ 谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）中的巯基能与活性 氧结合，终止脂类自由基（LPO）的生成。
自由基的检测方法
• 自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法 • 分光光度法 • 化学发光法 • 荧光分析法 • ·OH的其他检测方法
2.导致免疫系统功能紊乱
*自由基抑制淋巴细胞的增生分化，抑制其对刺激 原的反应性；
*改变K细胞和NK细胞的结构及功能，使其对靶细胞 的识别能力减弱；
*被自由基损伤的部分细胞自动修复，而修复后的 细胞具有了抗原性，干扰正常的免疫功能。
3.损伤基因，导致DNA变异
自由基可使DNA断裂或交联，从而诱发基因突 变或癌变。