10　Sheng W et al.J Virol,2003;77(6):385911　C ohen J I,et al.J Virol,1999;73(9):7627 12　Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13　G ao Y et al.Oncogene,2002;21(5):82514　T anner J E et al.J In fect Dis,1997;175(1):3815　Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16　Brink AA et al.J Clin M icrobiol,1998;36(11):3164 17　Hayes DP et al.M ol Pathol,1999;52(2):9718　zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745(2002211201　收稿)高通量SNP基因分型技术研究进展方唯意综述　姚开泰审阅中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要　在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。

发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。

本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。

关键词　高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。

通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。

人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。

经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。

寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。

在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。

1　一步均质法T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。

T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。

而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。

它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。

在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。

该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。

由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。

最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。

当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。

近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。

2　焦磷酸测序Pyrosequencing焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。

其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。

4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。

ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。

ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。

焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。

它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料的一种测序技术。

由于该法阅读侧翼序列和S NP 位点本身,以及其高度特异性(非特异性结合不产生假阳性信号)使得焦磷酸测序成为一种具有吸引力和准确的S NP基因分型方法。

焦磷酸测序除了提供高准确性、灵活性以及并行处理过程外,焦磷酸测序很容易实现全自动化的基因分型。

目前,Pyrose2 quencing AB公司已开发了适合于96孔中通量和384孔全自动化高通量的仪器,后者有能力每天进行数万个基因分型。

焦磷酸测序与一些标准基因分型方法相比,还有一些不利方面,即PCR反应时生物素标记引物价格较高,以及这种分析需要特殊仪器。

目前新研发了几种技术,旨在减少焦磷酸测序前的费用,主要是在模板制备方面,包括标准固相模板制备、三引物的固相模板制备和酶解模板制备[4]。

Pyrosequencing AB公司发展、制造和销售研究产品,这使得生命科学研究者能更有效地得到大规模基因组信息[5]。

3　DNA芯片/阵列分析当DNA芯片的技术开始出现时,它通过使用一个简单的等位基因特异性杂交检测技术为高度并行基因分型带来了巨大的希望。

然而到目前为此,以等位基因特异性杂交为基础的DNA芯片使用数量受到了一定的限制,主要是因为等位基因特异性杂交很难获得良好的信噪比。

在杂交反应中,完全匹配和非完全匹配的寡核苷酸区分的特异性受到了一定的限制,与DNA聚合酶或连接酶参与的区分反应相比,其特异性更低。

当许多不同的寡核苷酸如在同一条件下进行杂交反应时,这种特异性问题将变得更加突出。

尽管过去几年里想了很多的方法,其中包括高冗余芯片技术,但解决特异性这个问题一直并非易事。

由美国A ffymetrix公司研发的寡核苷酸S NP芯片就是利用寡核苷酸与DNA完全和不完全互补所造成的这种杂交在热稳定性上的差异来分析S NP。

近年来在Nature和Science发表的一些文章,就采用了这一芯片。

但这种芯片最大的缺点就是可靠性较差,对S NP位点较少分析时,该芯片可使误差小于1%,位点较多时,仅假阳性便可高达40%,这样的误差在临床应用时是绝对不允许的[6]。

鉴于目前S NP芯片研究状况和理论上对S NP芯片的需求,Zhang和Li[7]开发了一种新的技术,即3′末端标记引物延伸法。

它主要是利用聚合酶式反应原理,应用碱基特异性引物3′末端标记PCR的设计方案研发了一种进行S NP分析的芯片,这一技术的原理是将不配对的碱基置于3′末端或次3′末端。

这一设计的巧妙之处在于标记物或者说可检测信号,永远只会来源于完全配对的引物。

单碱基延伸与固相结合的寡核苷酸联合现已成功运用于微阵列S NP并行分析[8]。

该方法与等位基因特异性杂交平台相比,由于DNA聚合酶在结合互补反应中高保真性作用,其特异性信号更强。

这种方法的一个变化是在引物3′末端结合变异等位基因去检测等位基因特异性延伸。

基因标记分型法不断的发展,并能克服固相反应中对它的一些限制。

在这个系统中,一个高度多重单碱基延伸反应使用5′端标记序列、荧光标记的双脱氧二核苷酸的引物在溶液中进行。

引物中的标记序列本身并没有参与单碱基延伸反应,而是随后参与了与DNA芯片中的寡核苷酸结合。

以固相单碱基延伸为基础的标记阵列分析方法有如下优点:①由于价格的降低和它在不同S NP基因分型分析中使用相同DNA芯片的能力,普通DNA芯片也能够使用。

②在溶液中可进行酶学反应。

③因在寡核苷酸末端没有3′OH残基的存在,故在DNA芯片中应用时很少受到限制。

总之,标记阵列和单碱基延伸或基于连接酶解反应的联合运用提供了超高通量分析潜力的基因分型平台。

一些公司如A ffmetrix等一直致力于开发标记阵列基因分型系统。

4　微球(B ead-B ased)法这种分析方法是非常类似于DNA芯片分析方法,其区别在于微球法寡核苷酸粘附于直径3～5μm的微球体上,而不同于DNA芯片,固定在表面。

微球法能与用于DNA芯片标记阵列的大部分等位基因区分反应相结合,如单碱基延伸反应和寡核苷酸连接反应。

它在多重性和S NP联合上有着巨大的灵活性。

在微球法分析中,每一个微球体的身份都需要被确定,而且,这种信息将与来自于微球体的基因型信号相结合后指派一个基因呼叫信号到一个S NP中去。

因此,有必要对每个微球体进行分子鉴定和分类。

一个使用荧光编码的微球体基因分型平台已由Luminex公司开发出来。

这些微球体由两种不同的染料(红色和绿色)所包被,能基于微球体表面上两种染料的量多少,能通过流式细胞仪鉴定和分离。

如果有100不同信号比(红色/桔黄色)类型的微球体,那么有可能在一个反应管中做100次检测。

反应后,这些微球体被荧光检测器区分,而且,每一组的微球体的基因分型信号都受到单独的检测。

实质上,每一根反应管相当于DNA芯片上的100个位点。

现在,由于96孔流式荧光检测器的出现,在技术上有可能于96孔格式反应中对数千个基因型进行记分。

这种以微球体平台为基础的技术已经开始与寡核苷酸连接反应[9]、等位基因特异性杂交[10]、单碱基延伸法[11]和等位基因特异性引物延伸[12]联合应用。

尽管这种分析系统已经获得了合理高通量,但是,仍有一些因素限制了该系统向更高通量发展。

目前用于微球体检测的染料数目联合被设定在1002plex。

另外的限制因素是能够使用于基因分型信号染料的数量。

由Illumina公司开发的多种商业化柱子平台,它是由光学纤维制造出来的,微球体在固体孔中被捕获[13]。

每一个孔只适合一个微球体。

当微球体固定在这些孔中,这个系统便可作为一张高密度微阵列来对待。

在某种意义上说,Illumina微球体系统更象DNA芯片平台。

使用这种方法,50000个微球体能装配成一张微阵列片上。

这些特征使得光学纤维微球体阵列系统有一个非常高的多重性潜力。

5　质谱基因分型分析这种方法的原理是使用质谱直接或间接检测等位基因特异性延伸区分反应产物[14]。

各种等位基因区分反应如单碱基延伸及其变化形式[15]、等位基因特异性肽核酸(PNA)、Invader、碱基特异性裂解[16]和等位基因特异性PCR已成功的和质谱检测法联合应用。