光合细菌M-01的分离及培养条件研究[摘要]从湛江市霞山区海滩表层污泥中富集分离出红假单胞菌属光合细菌M-01,对其培养条件进行了初步探讨,结果表明:菌株生长温度为30e时,最适培养光照度为3 000 lx。
培养基正交实验结果表明其最优培养基配方为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾0.2 g,乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,氯化钠1 g,酵母膏0.15 g,硫酸镁0.2 g,T.M储液少量,蒸馏水1 000 mL。
其中乙酸钠为最大影响因子。
[关键词]光合细菌(PSB>。
分离。
培养。
正交实验光合细菌(Photosynthetic bacteria>是一类光合自养型古老细菌,具有较强的分解有机物特性,光合细菌作为水质净化剂广泛应用于水产动物如一些经济鱼类、虾蟹、贝类的养殖和育苗中[1~4]。
在生产上有意义的红螺菌科包括红螺菌属、红假单胞菌属和红微菌属[4]。
现已有学者对红假单胞菌的分离、鉴定、培养特性及保藏做了研究[5~7],但还没有关于其营养条件优化的报道。
笔者从海洋环境中分离到了光合细菌M-01,采用正交实验方法进行了培养条件优化的研究。
现将结果报告如下。
1 材料与方法1.1 材料(1>待分离材料取广东省湛江市霞山区海滩表层污泥。
(2>培养基使用红螺菌科富集培养基作为富集分离基础培养基[8]。
1.2 方法(1>菌株的分离筛选方法取污泥10 g,装入500 mL细口无色玻璃瓶中,加入富集培养液至满,盖上瓶盖,隔绝空气,于30e, 3 000 lx光照下进行富集培养3~4 d,培养液呈绛红色后,取富集培养菌液1mL,转接入培养液中,重复以上操作2次,然后采用改良的Hungate厌氧培养技术>>>柱滚管法[9]进行分离纯化,用分离培养基的琼脂柱穿刺培养后保存。
(2>细胞色素光谱吸收峰值测定方法培养物离心后洗涤,将细胞悬浮于60%的蔗糖溶液中,采用722S分光光度计扫描,波长范围为340~1 000 nm。
(3>生长量的测定为比较不同培养条件下(光照、接种量、营养条件>培养物生长量的差别,采用722S分光光度计检测培养物D660 nm值。
(4>光照度对菌株生长影响的测定将已接种的光合细菌培养液于温度30e,光照度分别为 2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 lx下培养3 d,每组3管,用722S分光光度计测定培养物菌液光密度D660 nm(用培养初刚接种的培养液为空白对照>。
(5>酵母膏添加量对菌株生长影响的测定在培养液中分别加入酵母膏,令其质量分数分别为0100、0105、0110、0115、0120、0125、0130 g/L。
(6>培养基正交实验根据预备实验,设计5因子4水平的正交实验(表1>,在温度30e,3 000 lx光照条件下进行培养基的正交实验。
#72#长江大学学报(自科版>2005年8月第2卷第8期/农学卷第25卷第3期Journal of YangtzeUniversity(Nat Sci Edit>Aug. 2005 Vol12 No18 /Agri Sci V, Vol125 No13表1 培养基正交实验因素水平Table1 Factor levels of orthogonal experimentof the culture mediag/L水平A氯化铵B磷酸氢二钾C乙酸钠D碳酸氢钠E酵母膏1 015 011 210 015 01052 110 012 310 110 01103 115 013 410 115 01154 210 014 510 210 01202 结果与分析2.1 菌株形态特征及培养特征共分离纯化菌株5株,记为M-01、M-02、M-03、M-04、M-05,均为棕红色菌落,培养特征类似,M-01株生长速度较快,以其做以下实验。
菌株M-01幼龄呈短杆状,不形成丝状体,细胞大小(016~019>Lm@(112~210>Lm。
芽生分裂,分裂时产生哑铃状的菌体。
鞭毛染色,可见极生鞭毛。
在光照厌氧液体培养中繁殖速度快,培养液起初呈浑浊状,淡黄色,后来逐渐出现絮状物,转变为浅红色,最后呈深红色。
在琼脂平板上菌落呈圆形,边缘整齐,表面凸起,光滑湿润,棕红色。
2.2 菌株的最大吸收波长图1为光合细菌活细胞的吸收光谱。
由图1可见,活细胞的吸收峰位于380、500、535、590、805、860nm等处,最大吸收波长为380 nm。
光合细菌在380、805、860 nm处具有吸收,表明光合细菌含有细菌叶绿素a,在500、590、535 nm处具有吸收,表明光合细菌的活细胞中还含有类胡萝卜素[10]。
活细胞吸收峰值表明M-01具有光合细菌典型吸收特征。
图1 光合细菌活细胞吸收光谱Figure1 The optical density of M-01living cells2.3 菌株的鉴定根据上述实验结果,又依据红假单胞菌属Rhodopseudomonas的形态、生理生化特征[10],初步确认菌株M-01为红假单胞菌属Rhodopseudomonas中的一种。
2.4 光照度对菌株生长的影响图2为不同光照条件下光合细菌M-01的光密度。
由图2可见,在温度30e,3 000~5 000 lx 时,该光合细菌均保持旺盛的生长势头,在实验培养中发现,4 000~5 000 lx光照条件下生长迅速,菌液迅速转红,但是细胞老化较快,易出现破碎细胞附壁现象,因而认为3 000 lx是该光合细菌的适宜光照度。
2.5 培养基中酵母膏添加量对其生长的影响图3为不同酵母膏添加量时光合细菌M-01培养48 h的光密度。
由图3可见,添加酵母膏对菌株生长有明显的促进作用,但是当酵母膏添加量为011 ~ 013 g/L时,光合细菌培养48 h时菌液光密度值差别不大,由于酵母膏同时有促进其它菌类生长的作用,为减少杂菌污染的机会,结合生产中降低成本的要求,笔者认为酵母膏添加量为0110 ~ 0115 g/L是合适的。
#73#农学卷第25卷第3期操玉涛等:光合细菌M-01的分离及培养条件研究图2 光合细菌M-01在不同光照度下的光密度Figure2 The optical density of thephotosynthetic bacteria M-01图3 不同酵母膏添加量时M-01培养48 h的光密度Figure3 The optical density of48h M-01liquidwith different yeast paste contents表2 正交实验结果Table2 The results of orthogonal experiment编号各因素水平氯化铵A磷酸氢二钾B乙酸钠C碳酸氢钠D酵母膏ED660 nm1 1 1 1 1 1 011892 1 2 2 2 2 116703 1 3 3 3 3 115844 1 4 4 4 4 118685 2 1 2 3 4 115136 2 2 1 4 3 118347 2 3 4 1 2 110508 2 4 3 2 1 210939 3 1 3 4 2 2106810 3 2 4 3 1 2123611 3 3 1 2 4 1122912 3 4 2 1 3 1180213 4 1 4 2 3 2138114 4 2 3 1 4 2122215 4 3 2 4 1 1176516 4 4 1 3 2 11179X111328 11538 11108 11316 11571X211623 11990 11687 11843 11492X311834 11407 11992 11628 11900X411887 11736 11884 11884 11708R01559 01583 01884 01568 01408 2.6 培养基优化从表2极差R值可以看出,5因素影响光合细菌生长的主次顺序是: C>B>D>A>E,因素C乙酸钠对光合细菌生长的影响十分明显,因素E酵母膏对生长的影响最小。
根据表4 均值大小,最佳培养基配方组合为A4、B2、C3、D4、E3,综合以上结果,本实验菌株的最佳培养基配方及培养条件为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾012 g, 乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,酵母膏011 g,硫酸镁012 g,氯化钠1 g,T1M储液少量,蒸馏水1 000 mL,培养温度30e,光照3 000 lx。
3 结论与讨论光合细菌M-01在光照厌氧液体培养中繁殖速度快,培养液起初呈浑浊状,起初为淡黄色,以后转变为浅红色,最后呈深红色。
该光合细菌菌株在30e连续光照条件下生长迅速,较少发生附壁和产生细胞碎片,34e以上时细胞附壁和产生细胞碎片明显增多,25e以下生长速度低,因此25 ~ 30e为较适宜的生长温度。
本实验分离的光合细菌M-01在3 000 lx左右的光照度下,很短时间即进入对数生长期,经过36 h,菌液颜色棕红色,表现出了较高的生长活性。
经过20亿年的进化,光合细菌已能在水圈生态系多个子生态系中生活,表现出很强的适应能力,这与光合细菌代谢能力的多元化是分不开的,因此,不同生态环境中的光合细菌对营养物质的利用必然存在差别.本实验从红螺菌科光合细菌富集培养基[9]出发,得到了现有光合细菌菌株M-01的最适培养培养条件,说明了对特定的种类而言,最适培养条件会有差异。
在适宜的培养条件下,光合细菌可保持较好的生#74# 长江大学学报(自科版> 2005年8月长活性,有利于生产及保藏。
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