光合细菌的分离、培养和鉴定摘要：从南湾水库大坝下层水域取水样获得一株光合细菌。
采用多种培养基分离方法分离出纯培养物。
进行了菌落形态学观察和亚显微观察。
于不同条件下培养后分别测定光密度和生长曲线。
实验证实分离到的菌种为沼泽红假单胞菌。
关键词：生长曲线；沼泽红假单胞菌；光合细菌The separation and culture and identified of photosynthetic bacteria Abstract:A strain sample of photosynthetic bacteria was got from the lower water in South Bay Reservoir. using a variety of separation methods to get pure cultures. It was cultured with various medium to culture the pure strains. Transmission election micrographs and microscope were observed of the strain. The optical density (OD) and the growth curve were measured under different conditions. The results suggested that the strain was Rhodopseudomonas palustris.Keywords:Colony and cell; Growth curve; Rhodopseudomonas palustris; Photosynthetic bacteria引言光合细菌由于碳、氮代谢途径和光合作用机制的独特性和其生理类群的多样性, 而被大量关注。
多年来, 光合细菌一直被作为研究光合作用以及生物固氮作用机理的重要材料。
经过研究发现光合细菌在环保、农业、医药等方面均有较高的应用价值。
下面就光合细菌目前的开发应用研究近况作一概述。
光合细菌细胞营养价值极高。
首先，光合细菌细胞干物质中蛋白质含量高达60%以上, 比目前生产的单细胞蛋白酵母中蛋白质的含量还高。
而且其蛋白质氨基酸组成齐全, 是一种优质蛋白源。
其次，光合细菌细胞含有多种维生素, 特别是B族维生素, VB12、叶酸、泛酸、生物素的含量远远高于酵母菌。
另外, 光合细菌细胞还含有大量的类胡萝卜素、辅酶Q等活性物质。
因此, 光合细菌具有很高的营养价值。
在水产养殖中, 光合细菌可被用于饵料或饲料添加剂。
光合细菌促进鱼虾的生长, 无论是成活率或是产量的提高均可达10%-40%以上。
同时，光合细菌还具有防治鱼虾疾病,净化养殖场所水质等方面的功能。
使用光合细菌喂养的家禽, 成活率可提高5%-7%, 料肉比降低33%左右，肉鸡增重15%-17%, 产蛋率提高12.7%。
而且所产蛋的蛋黄颜色明显亮泽发红, 这是因为卵黄中维生素C、类胡萝卜素含量提高20%左右。
现在人们都大力提倡使用有机肥料和“生物农药”。
而光合细菌已被证明不但是一种优质的有机肥料同时可以增强植物的抗病能力。
光合细菌可作为底肥、或以叶面喷施、拌种等方式应用到作物。
利用光合细菌处理有机废水，在国外已得到初步应用。
小林正泰等在日本自六十年代起，首先开展了用使PSB处理有机废水的试验研究，先后成功地用光合细菌对粪尿、淀粉、食品、皮革、豆制品等废水进行处理，建并立了一批日处理几十吨、几百吨至几千吨高浓度有机废水的大中型净水系统, 运行多年证实效果良好。
近年来，美国、澳大利亚等也相继进行了这方面的研究工作。
我国对此也进行了一些研究。
上海交通大学生物技术研究所利用光合细菌对豆制品、洗毛、牛粪等废水进行处理，并在小林正泰的帮助下与南通发酵厂合作，用PSB法成功地进行日处理150吨柠檬酸废水的研究，取得了中试成果。
吴国庆等使用红螺菌对12种染料进行了初步脱色实验，在黑暗厌氧条件下红螺菌对其中的12种染料具有良好的脱色作用。
光合细菌法处理污水主要有以下优点:a、除氮效果好，耐盐能力强;b、不存在污泥的处置问题，处理后的污泥都是很好的有机肥料;c、有机负荷高，光合细菌可直接处理几千至几万COD的高浓度有机废水，并且无需稀释;d、投资费用低，占地面积小，消耗动力低，节省能源;e、便管理，在10-40℃内均可处理，受季节影响小。
总的来说，光合细菌还是一种废水处理的好方法。
光合细菌中如红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomon- as)、红微菌属(Rhodomicrobium)等属细菌在新陈代谢过程中都会释放氢气。
生物制氢是利用微生物代谢过程生产分子氢的一项生物工程技术，是人们开发新能源的一个方向。
光合细菌利用有机废水产氢是一个重要的研究开发内容。
一方面有机废水可以为光合细菌提供大量廉价的有机基质，尤其是高浓度的有机废水，其溶解氧极易被好氧或兼性厌氧微生物消耗后造成厌氧环境，从而有利于光合细菌产氢。
另一方面产氢的同时还伴随有机物的降解和光合细菌菌体的生成，废水就可以得到净化。
如使用深红红螺菌(R.rubrum)分解有机物进行光合产氢，产量高达65mg/L，比蓝细菌产氢量高一倍多。
目前，我国国内有将光合细菌菌剂制成鱼虾宝、鸡鸭宝等产品各种。
国外公司利用光合细菌制成微生态制剂，如EM制剂等等。
此外光合细菌还被制作为保健食品，经动物实验表明光合细菌具有延缓衰老、抑制肿瘤、免疫调节的显著功效，这可能与光合细菌细胞中富含类胡萝卜素和B族维生素及活性物质等有关。
光合细菌也是提取天然药物的良好素材之一。
山西大学利用光合细菌提取抗癌药，中国科学院与山西安泰生物工程公司共同研制了“安泰369口服液”就是利用了光合细菌网，太原康强药业有限公司研制的康强胶囊就是光合细菌与中药组分结合用于治疗糖尿病。
此外，1992年，全美保健食品中有6.5%都加有光合细菌，最具代表性的当属新奥尔良·贝鲁斯潘有限公司投产的PGH浓缩液含维生素、微量元素、氨基酸。
可调节内分泌提高机体免疫能力，上市后至今畅销不衰。
还有一种叫“米格申”的含光合细菌菌液的饮料可以在健全中枢神经、预防老年痴呆上效果显著。
在日本，光合细菌饮料也因为具有延缓衰老的作用以及在防止心脏病、脑梗塞、癌症等方面的功效而倍受青睐。
因此对光合细菌的研究很有实用价值和现实意义。
本实验通过对本市南湾水库大坝下层水域和附近鱼塘底泥进行采样，经过分离和富集培养得到纯的培养物，再对纯菌株进行鉴定证实分离出了沼泽红假单胞菌，是一种非常有利用价值的光合细菌。
此实验对以后进一步研究和开发利用光合细菌很有意义。
1.采样和分离、培养的方法1.1样品的采集2009年10月从信阳市南湾水库大坝下层水域取水样及附近鱼塘底泥取样。
1.2培养基的配置富集培养基：NH4Cl 0.1 g, NaHCO3 0.2g(5%水溶液,过滤除菌取4ml加入),K2HPO4 0.02g, NaCH2CO3 0.1～0.5g(取0.3 g), MgSO4(H2O)7 0.02g,NaCl0.2g,酵母膏0.1g,蒸馏水96ml, pH 7.0。
半固体培养基：1％的比例在富集培养基中添加琼脂。
固体培养基：2％的比例在富集培养基中添加琼脂。
将样品用富集培养基富集分装至试管，每管加样品1克后再加灭菌液体石蜡，隔绝氧气培养。
当其培养液变色后, 重复进行富集培养2-3次后进行纯化分离:(1)取富集液划线于固体培养基表面，采用焦性没食子酸去氧法进行厌氧光照培养重复2-3次以获得纯培养物。
(2)采用双层平板法，下层平板为2%固体培养基，划线接种后上层倒1%半固体培养基。
(3)下层平板为2%固体培养基，接种后，倒入灭菌的液体石蜡覆盖3-4毫米。
培养条件:28-30℃;白炽灯光照,照度为2000-2500lx；好氧条件,培养时间为7-14d。
富集培养过程中发现部分试管变红色，少部分试管变绿色，获得纯培养物后，有红色菌落和绿色菌落，将菌落移至斜面培养基保存留作研究使用。
1.3 富集培养将红色菌落接种于富集培养基中，倒入灭菌的液体石蜡覆盖3-4毫米。
培养条件:28-30℃;白炽灯光照,照度为2000-2500lx;微好氧条件,培养时间为7-14d。
1.4 显微镜观察1.4.1 菌落及菌体形态学观察以琼脂平板上生长的菌落形态记述;菌体形态以光学显微镜与电子显微镜相结合;用电镜观察细菌鞭毛、繁殖方式及光合内膜结构类型。
1.4.2 电子显微镜制片用2.5％戊二醛和2％锇酸双重固定，丙酮系列脱水。
lxm812包埋，LKB超薄切片机切片，切片经醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色后，于Hitachi600 A2型透射电镜下观察并拍照。
1.5 光合细菌光密度(OD)的测定生长曲线通常，光合细菌数量的多少可用光密度值来衡量。
细菌菌体是不透光的，光束通过细菌悬液将会由于被散射或被吸收而降低其透过率。
细菌悬液的浓度同光密度成正比，同透光度成反比，而光密度或透光度可以借光电池精确测出，所以可用光密度来表示细菌相对数目。
不同培养条件培养光合细菌，将分离到的菌株分别在光照好氧，光照厌氧，黑暗好氧，黑暗厌氧四种条件下培养7-14天，测其在波长663nm处的OD值,记录并比较其生长曲线。
2.结果2.1 光合细菌菌落和菌体形态学观察2.1.1 光合细菌的菌落形态分离到的光合细菌为二红色菌株，暂命名为PSB-1、PSB-2.其菌落特征见表2-1 表1分离菌株的菌落特征项目细胞形细胞大鞭毛革兰液体培增值方式菌落形态状小（μm）氏染色养PSB-1 杆状0.5×1.5 单根极生__ 红二等分裂深红色，边缘整齐，中间隆起，表面湿润，D=1-2mmPSB-2 弧状0.5×1.5 单根极生—红二等分裂深红色，边缘整齐，中间隆起，表面湿润，D=1-2mm2.1.2 PSB-1的菌体形态革兰氏染色结果见图2-1图2-1 PSB-1革兰氏染色(×1000)2.1.3 PSB-1的透射电镜照片PSB-1的透射电镜照片见图2-2图2 光合细菌的电镜照片Fig. 2 Transmission election micrographs (TEM) of the cell of the bacteria2.2 光合细菌生长曲线不同培养条件培养光合细菌分离到的菌株分别在光照好氧，光照厌氧，黑暗好氧，黑暗厌氧四种条件下培养7-14天，测其在波长663nm处的OD值,记录并比较其生长曲线。
PSB-1，2均在光照厌氧条件下生长最好。
见图2-3 PSB-1在不同条件下的生长曲线3.结果分析证实了分离到的菌种为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。