免疫组化原理及流程介绍
5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
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•
一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。 • 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗 体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和 从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要 摸索。
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★除上述对照结果分析之外，还必 须从以下几个方面综合评价：
1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质 具有结构性。（非特异性染色 细胞与 组织无区别） ② 染色强度不同：颜色深浅不一（非 特异性染色 弥散性均匀）。
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2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘干燥—非特异性染色（常见）， 加抗体时勿干片。
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通常在过氧化物酶（HRP）法中，显 色剂为DAB。
DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)
配法:DAB 50mg
ABC 法 SP法
0.05M TB 100ml
30%H2O2 30-40ul
PAP法
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9、复染、脱水、透明、封片
复染：目的是形成细胞轮廓，从而更 好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂 为苏木素。 片子复染完后流水振洗，然后臵于盐酸 酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水 振洗，在放入氨水中返蓝即可。
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• 4.一抗的清洗： （1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐 用浸洗方式； （3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。
具体操作： 1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已 稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反应
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。 该法是ABC法基础上的进一步改良， 使卵白素与链霉（而非生物素）结合， 而后再结合PO基。
⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快且粘 附剂太厚。
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（3）所有切片背景过深
① 内源性过氧化酶没有完全阻断
② 切片或涂片过厚
③ 漂洗不够
④ 底物呈色反应过久
⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血
⑥ 使用全血清抗体稀释不够
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（4）阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应。
(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液配臵中未加氯化钠和PH值不准确， 洗涤不彻底。 ③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。
1.脱蜡与水化
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其 他试剂能够充分与组织中抗原等结合发 生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶 性反应和浸洗不全，而产生非特异性背 景着色。
1)60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2)100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
3．人工假象与特异性结果显示不在同一 平面上。
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▲染色失败的几种原因：
染 色 失 败 的 可 能 情 况 (1)所染的全部切片均为阴性结 果，包括阳性对照在内。 (2)所有切片均呈阳性反应 (3)所有切片背景过深 (4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应
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目的是使抗体能够充分地进入胞内 进行结合反应。一般用Triton X-100、 蛋白酶k等通透液。
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(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧 化物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。
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1.防止脱片；2.使抗原 抗体结合更稳定。
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具体做法： 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周 围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1： 250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
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6.二抗孵育
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四 免疫组化结果分析
免疫组化结果的判断原则： 1.必须设对照。 2.抗原表达必须在特定部位。 3.阴性结果不能视为抗原不表达。
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实验分析的相关介绍
阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待 检标本同时进行免疫细胞化学染 色。对照切片呈阳性结果，标为 阳性对照。
免疫组化的原理及流程介绍
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• 主要内容
一.免疫组化的发展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的基本流程 四.免疫组化的结果分析
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一.发展简史
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根 过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术， 使免疫细胞化学得到广泛应用。
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• 1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加 一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜 蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再 用 PBS 返蓝 5 min。 • 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 • 3) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min • 4) 封片：中性树胶。
最常见的原因是：
标本的固定和处理不当
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注意事项：
• 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳 性染色的位臵。 • 2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆 盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但 又防止干片 。
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• 3.以下原因可能导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜 的 二甲苯中； • ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； • ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； • ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； • ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 • ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团），作用是检测一抗。
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•
二抗孵育条件：二抗一般室温或37度 30min-1h，具体时间需要摸索。 • 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度 和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和 孵育时间。
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具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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3. 抗原修复 暴露抗原决定簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多 聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间 交联及醛基的封闭作用，从而失去抗 原性；通过抗原修复，使得细胞内抗 原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
3)95% ethanol 2 minutes；
4)80% ethanol 2 minutes；
5)70% ethanol 2 minutes；
6)distilled water:5 min；
具 体 操 作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
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2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
(1)细胞通透
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4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有交叉反应的位点发生结合。
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具体操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化 笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊 血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约30℃)下10～30min。 大一点
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SP染色法的特点:
灵敏特异性低，成本低。
具体操作：
1） 加入 SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2） 用 PBS 洗 5 次×5 min。
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8.显色
在免疫组化中，由于抗原抗体所 形成的复合物本身没有颜色，不能 直接观察，只能借助于其他某些化 学基团的显色作用，是复合物显色， 有利于显微镜下观察。
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抗原修复的主要方法:
常用的修复方法从强到弱一般 分为三种，高压修复、微波修复、 胰酶修复。
酶消化方法 一般用于细 胞内抗原 应用高频电磁波 打开蛋白质间的 交联键