实验七-食品中还原糖的测定(综合性)实验七面粉中还原糖的测定（综合性实验）课程：食品检验与分析班级：2011级食品1、2班地点：A13-0405 指导教师：蔺芳（一）直接滴定法一、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

样品经除去蛋白质后，在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液直接滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液，达到终点时，稍过量的还原糖把蓝色的次甲基蓝指示剂还原为无色，而显出氧化亚铜的鲜红色。

根据样品液消耗体积，计算出样品中还原糖的含量。

各步反应式（以葡萄糖为例）如下：(1) Cu2SO4＋2NaOH = 2Cu(OH)2↓＋Na2SO4(2) Cu(OH)2＋KNaC4H4O6= KNaC4H2O6Cu ＋2H2O(3) C6H12O6＋6KNaC4H2O6Cu＋6H2O = C6H12O7＋6KNaC4H4O6＋3Cu2O↓＋H2CO3从上述反应式可知，1mol葡萄糖可以将6mol Cu2＋还原为Cu+。

但实际上此反应为非定量反应，即不能根据反应式直接计算出还原糖含量。

因此在测定过程中要严格遵守所规定的操作条件，如热源强度(电炉功率)、锥形瓶规格、加热时间、滴定速度等。

二、适用范围及特点本法又称快速法，特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。

适用于各类食品中还原糖的测定。

但测定酱油、深色果汁等样品时因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。

本法是国家标准分析方法。

三、试剂及玻皿配置仪器 1. 200mL 烧杯 2 个 2. 100mL、250mL、1000mL 容量瓶各 1 个3. 5.0mL 移液管 4 支4. 25mL、 100mL 量筒各 1 个5. 250mL 锥形瓶 4 个6. 800W 电炉 1 个7. 恒温水浴锅、干燥箱8. 碱式滴定装置 1 套9. 玻璃珠（适量） 10. 滤纸、漏斗及过滤装置 11. 分析天平试剂 1. 碱性酒石酸铜甲液：称取 15g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O )及 0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释到 1000mL。

2. 碱性酒石酸铜乙液：称取 50g 酒石酸钾钠及75g 氢氧化钠，溶于水中，再加入 4g 亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至 1000mL, 贮存于橡皮塞玻璃瓶中。

3. 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加 3mL冰醋酸，加水溶解并稀释到 100mL。

4. 10.6％亚铁氰化钾溶液：称取 10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6· 3H2O]溶于水中，稀释至 100mL。

5. 葡萄糖标准溶液：准确称取 1.0000g 经过98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后移入 1000mL 容量瓶中，加入 5mL 盐酸(防止微生物生长)，用水稀释到 1000mL。

四、测定方法（1）样品处理视样品含糖量的多少，称取 2～10g 样品。

例如面粉，准确称样 10 克左右于 200mL 烧杯中,加入 100～150mL 温水，搅拌，置于 45℃恒温水浴锅中，放置 45min，中间不时搅拌，取出，将提取液移入 250mL 容量瓶中，慢慢加入 5mL 乙酸锌溶液和 5mL 亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置 30min。

用干燥滤纸过滤，弃去 15～20mL 初滤液，收集滤液备用。

(2) 碱性酒石酸铜溶液的标定准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各 5mL，置于 150mL 锥形瓶中，加水 10mL，加玻璃珠 3 粒。

从滴定管滴加约 9mL 葡萄糖标准溶液，加热使其在 2min 内沸腾，准确沸腾 30秒钟后，趁热以每 2 秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。

平行操作 3 次，取其平均值，按下式计算 10mL 碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量。

F = C×VS式中：F——10mL 碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量, mgC——葡萄糖标准溶液的浓度，mg／mL；V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，SmL。

(3) 样品溶液预滴定吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各 5.00mL，置于 150mL 锥形瓶中，加水 10mL，加玻璃珠 3 粒，加热使其在 2min 内沸腾，准确沸腾30 秒钟后，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态。

待溶液蓝色变浅时，以每 2 秒 1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录样品溶液消耗的体积。

(4) 样品溶液精确滴定吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各 5.00mL，置于 150mL 锥形瓶中，加玻璃珠 3 粒，从滴定管中加入比预测时样品溶液消耗总体积少 1mL 的样品溶液，加热使其在 2min 内沸腾，准确沸腾 30 秒钟后，以每 2 秒 1 滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗样品溶液的总体积。

平行操作 3 次，取平均值。

五、结果计算式中：m——样品质量，g，F ——10mL 碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg；Vx ——测定时消耗样品溶液的平均体积，mL；V ——样品溶液的定容体积，mL。

六、说明与讨论1.碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都可被氧化，所以测得的是总还原糖量。

2.本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液(Cu2+量一定)消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2+的含量是定量的基础，因此在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2+，得到错误的结果。

3. 次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比Cu2+弱，故还原糖先与Cu2+反应，Cu2+完全反应后．稍过量的还原糖才与次甲基蓝指示剂反应，使之由蓝色变为无色，指示到达终点。

4. 为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，使之与Cu2O生成可溶性的无色络合物，而不再析出红色沉淀。

5. 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

6. 滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，无色的还原型次甲基蓝与空气中氧接触时又会被氧化为蓝色的氧化型。

此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。

保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。

7. 滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

8. 样品溶液预测的目的；一是通过预测可了解样品溶液浓度是否合适( 1mg/mL 左右)，样液的浓度应与标准糖液的浓度相近，使预测时消耗样液量在 10mL 左右；二是通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少 1mL 左右的样液，只留下 1mL 左右样液在续滴定时加入，以保证在 1min 内完成续滴定工作，提高测定的准确度。

9. 影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。

反应液的碱度直接影响二价铜与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。

因此，必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。

热源一般采用 800w 电炉，热源强度应控制在使反应液在 2 min 内沸腾，且应保持一致。

沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多；滴定速度过快，消耗糖量多。

因此，测定时应严格控制上述实验条件，应力求一致。

平行试验样液消耗量相差不应超过0.1mL。

（二）3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验原理在氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3，5－二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成氨基化合物。

此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定浓度范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系。

二、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料面粉2．主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL ×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2；10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）电炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计3．试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。

三、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD-540nm）0 0 2 1.5 01 0.2 1.8 1.5 0.22 0.4 1.6 1.5 0.43 0.6 1.4 1.5 0.64 0.8 1.2 1.5 0.85 1.0 1.0 1.5 1.06 1.2 0.8 1.5 1.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。

调分光光度计波长至540 nm，用0号管调零点，等后面7~10号管准备好后，测出1～6号管的光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2. 样品中还原糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00 g食用面粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 mL 蒸馏水，搅匀，置于50 ℃恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。

过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（2）显色和比色取2支20 mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。