1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。

2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。

3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。

4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。

5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。

催化游离dNTP之间相互聚合。

7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。

8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。

9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。

10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。

1、RT-PCR的基本原理将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。

分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE3 毛细管电泳3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度（1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。

(2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。

4、PCR的基本原理和基本步骤，知道几种PCR（1）基本原理是以待扩增的DNA分子为模板，以一对人工合成的、分别与模板的5’端和3’端互补的单链寡核苷酸作为引物，在耐热DNA 聚合酶催化下，按照半保留复制的原则合成两个子代DNA；接着以子代DNA为模板再次合成，如此反复循环十数次，最终将原始模板放大数百万倍。

（2）PCR的基本步骤1.反应体系：包括模板DNA，耐热DNA聚合酶，两种引物，4种dNTP和含有镁离子的缓冲液。

2.反应过程变性:将反应体系加热加热到94~95度，持续30秒左右，使待扩增DNA完全解链成单链。

退火：使温度迅速下降到适宜温度并维持30秒，使引物与模板DNA 两条链的3’端互补配对。

退火温度由引物Tm决定，一般比引物的Tm低5度，其范围常在55~68度。

延伸：将反应体系温度升高到72度，此时DNA聚合酶将以单链DNA 为模板，将单核甘酸逐个添加到引物的3’端，使新链不断延长，直至合成结束。

（3）PCR种类：反转录PCR，定量RT-PCR，实时荧光定量PCR，多重PCR,巢式PCR,反向PCR,原位PCR5、基因组DNA提取的原理（主要应用的试剂和作用）SDS蛋白酶法：主要用于提取动物组织细胞的基因组DNA。

（1）首先利用含有SDS、蛋白酶K等成分的DNA抽提缓冲液作用于组织匀浆液，以充分裂解细胞，破坏染色体结构，并使组蛋白及其他胞内蛋白质变性、降解，释放出游离的DNA；（2）用酚/氯仿、氯仿/异戊醇等有机溶剂依此抽提，除去水相中的蛋白质、酚等杂质；（3）最后以乙醇或异丙醇沉淀水相即可得到较纯的基因组DNA。

抽提缓冲液中的RNA酶可降解胞内RNA，乙二胺四乙酸（EDTA）则能有效抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。

CTAB法与SDS蛋白酶法提取DNA的过程相似。

6、RT-PCR反应体系中包括哪些试剂？他们的作用如何？1.RNA提取试剂：迅速破碎细胞并抑制细胞内RNase的同时，使核蛋白复合物变性，释放RNA。

2.反转录酶：以mRNA为模板合成cDNA。

3.第一链cDNA合成试剂盒：合成cDNA。

4.RT-PCR引物：催化游离dNTP之间相互聚合。

5.dNTP：为扩增DNA的原料。

6.Taq DNA聚合酶：在高热条件下，催化聚合反应。

生物化学与分子生物学实习指导（中文版）生物化学与分子生物学实习指导实验一蛋白质含量测定(比色分析法和分光光度法)实验二从小鼠肝脏中提取DNA实验三DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳实验四现代PCR技术实验五人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分离及鉴定内容一盐析法，凝胶过滤法内容二纤维素离子交换层析，蛋白含量测定，酶活性测定内容三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳内容四总结实验六酶的特异性、激动剂、抑制剂实验七温度、pH对酶促反应速度的影响实验八运动对尿中乳酸含量的影响实验九肝糖原实验实验十肝脂质的提取及薄层层析实验一蛋白质含量测定(比色分析法和分光光度法)【目的要求】1. 掌握比色分析法和分光光度法基本原理、标准曲线的制作及使用，标准管法结果计算2. 熟悉蛋白质含量测定常用方法、原理及应用3. 了解常用可见光、紫外分光光度计的测定原理及使用【教学内容】1. 酚试剂法蛋白质含量测定Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理, 722型分光光度计使用，常用蛋白质含量测定方法及应用，酚试剂法测定蛋白质含量原理、操作, 标准曲线的制备及使用2. 双缩脲法蛋白质含量测定自学和独立完成实验并与酚试剂法比较，结果计算3. 紫外分光光度法蛋白质含量测定紫外分光光度法测定蛋白质含量原理，方法，优缺点，注意事项；国产752型紫外分光光度计使用，UV—260分光光度计使用，注意事项，波长扫描，标准曲线制作【实验原理】一、比色分析法许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色，在加入适当的显色剂后生成有色物质。

溶液浓度越大，颜色越深。

因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。

这种方法叫比色分析法。

1. 物质的颜色和波长：可见光：波长（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm红外光：λ大于760nm光的互补：将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到白光，这两种光叫互补光，该现象叫光的互补。

单色光：白光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光，把具有一种波长，不能再分解的光叫单色光。

2. 溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。

溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。

溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。

例如：一束白光通过核黄素溶液，溶液呈黄色，是因为蓝色光被吸收，而其它颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。

光吸收曲线：测定同一物质对不同波长光线的吸收程度，以波长为横坐标，光密度为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。

3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。

溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。

lg I0 / I 意义：当I = I0 时，lg I0 / I=0，表示溶液完全不吸收光线；当I＜I0时，lg I0 / I值较大，表示溶液对光吸收较多；当I→0 时，lg I0 / I值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。

由此可见，lg I0 / I表示了溶液对光的吸收程度。

表示方法：光密度OD或D（opticaldensity）吸光度A（Absorbance）消光度E（Extinction）于是，(3)式可写成：D = KCL公式中K为消光系数，K = D/CL，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。

同一溶质，K值相同。

百分消光系数：C = 1%，L = 1cm克分子消光系数：C = 1克分子浓度，L=1cmD=KCL意义：物质对光吸收程度与该物质的消光系数K，溶液浓度C，液层厚度L成正比。

4. 待测溶液浓度的计算：（1）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算：标准液：Ds = KsCsLs待测液：Du = KuCuLu其中，Ls = Lu，Ks = Lu，Ds/Du = Cs/CuCu =（Du/Ds）×Cs（2）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。

先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。

在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。

以各管D为纵坐标，C 为横坐标，绘制标准曲线。

待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。

（3）标准系数法：多次测定标准溶液的光密度后求出平均值，标准系数= 标准液浓度/标准液平均光密度，同法测出待测液的光密度代入下式：C = 待测溶液光密度×标准系数（4）消光系数法：1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1%或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξC = D/E1cm%, 或C = D/ξ常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。

优点：可直接测定，不需呈色，不损失样品, 操作简便注意：选择1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光区强烈吸收紫外光，不能使用）二、比色分析的测定方法1. 比色分析法：原理：白光透过滤光板后，可得到近似的单色光，让单色光透过有色溶液，然后射到光电池上，光电池受光放出电子，所产生的电流与光的强度成正比关系。

利用滤光板可获得近似的单色光，波长范围30-50nm。

滤光板最易透过的光是有色溶液最易吸收的光。

一般说来，选择滤光板的颜色应与被测溶液的颜色为互补色。

2. 分光光度法：分光光度法使用分光光度计，利用棱镜或光栅获得单色光，波长范围3-5nm，所以比比色分析法的灵敏度，准确度和选择性都要高。

三、比色分析条件的选择1. 波长的选择：原则“吸收最大，干扰最小”例：A，B两种物质，A物质最大吸收峰在a处，B物质在a处也有吸收，对A物质的测定有干扰，故选b处波长进行比色测定以满足以上原则。

2. 光密度的选择：D值读数在检流计标尺中部时，准确度较高，相对误差最小。