（1）动物细胞基因工程技术和杂交瘤技术 动物细胞培养技术的发展是建立在动物 细胞重组技术和融合技术基础之上的.至今, 细胞重组技术和融合技术基础之上的.至今, 通过杂交瘤细胞培养已制备了大量的单克 隆抗体, 品种不下万种, 隆抗体, 品种不下万种, 其中数百种已在医学 和生物学的各个领域得到了广泛的应用。 到90 年代初期, 世界单克隆抗体的销售已超 年代初期, 过30 亿美元 , 取得了明显的社会效益和经济 效益。
二、动物细胞培养技术的实际应 用与成就
1、实际应用 （1）生产天然药用蛋白 （2）基因重组蛋白的临床应用 （3）制备单克隆抗体 （4）对环境和动物保护的作用 （5）新药研发
2、成 就 80 年代以来, 随着基因工程技术以及细 年代以来, 胞融合技术的进一步发展, 胞融合技术的进一步发展, 动物细胞培养在 药品的生产方面开始发挥重大作用。近年 来生化工程界认识到动物细胞培养的潜在 商业价值, 商业价值, 开始把巨大的人力和资金投入到 该领域中, 该领域中, 使细胞培养的原理和方法日臻完 善。
（3） 无血清培养技术 由于血清中成分复杂, 由于血清中成分复杂, 给培养过程的后 处理带来了困难, 而且成本很高, 处理带来了困难, 而且成本很高, 于是动物细 胞无血清培养的研究就成为生物技术领域 中的一项重要研究课题, 中的一项重要研究课题, 并在近年内取得了 很大进展, 很大进展, 首先体现在与无血清培养基有关 的理论及认识的提高。
b 微载体法:微栽体法是Wezel 在1967 年首先创 微载体法:微栽体法是Wezel 建的。所采用的微栽体是由天然葡聚糖聚合物或 其他聚合物制成的固体小珠,其直径约在50 其他聚合物制成的固体小珠,其直径约在50 微米到 数百微米之间。微载体法是一种完全将贴壁培养 和悬浮培养融为一体的培养方法。但能使细胞均 匀分布,提高了对培养液和培养空间的利用, 匀分布,提高了对培养液和培养空间的利用,而且适 于各种细胞的大规模培养,收获过程简单, 于各种细胞的大规模培养,收获过程简单,放大生产 也很容易。 c微囊法：先将欲培养的动物细胞悬浮于海藻 酸钠溶液中,之后使其通过一种成滴装置，而逐滴 滴入CaCl2 溶液中,海藻酸钠一旦进入CaCl2 溶液后 即形成半透膜微囊,从而将细胞封闭在其内。然后 再将微囊悬浮于培养液中培养。
（3） 大规模培养法 动物细胞大规模培养技术是在贴壁培 养和悬浮培养的基础上, 养和悬浮培养的基础上,融合了固定化细胞、 流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以 及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展 起来的。其后, 起来的。其后,随着生物技术产品倍受世人 亲睐, 亲睐,动物细胞大规模培养技术也随之得到 了迅猛发展, 了迅猛发展,并形成了几种比较成熟且有应 用价值的大规模培养方法。
3、动物细胞的培养方式 （1） 贴壁培养法 大多数动物细胞在离体培养条件下都需要 附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面 上才能正常生长, 上才能正常生长,并最终在附着表面扩展成单 层。其基本操作过程是: 层。其基本操作过程是:先将采集到的活体动物 组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 或化 学(酶消化法) 的方法分散成细胞悬液,经过滤、离 酶消化法) 的方法分散成细胞悬液, 心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养 皿(瓶、板) 中,再放入二氧化碳培养箱进行培养。 瓶、板) 用此法培养的细胞生长良好且易于观察, 用此法培养的细胞生长良好且易于观察,适于实验 室研究。
（2） 新型细胞培养反应器及其监测调控技术 由于动物细胞与微生物细胞有很大的差异, 由于动物细胞与微生物细胞有很大的差异, 如 动物细胞没有细胞壁, 非常脆弱, 对剪切敏感等, 动物细胞没有细胞壁, 非常脆弱, 对剪切敏感等, 因 此, 对体外培养环境有更为严格的要求。传统的微 生物发酵反应器显然不能适用于动物细胞的大规 模培养, 模培养, 由此促进了新型细胞培养用生物反应器的 研究和开发。自70 年代以来, 研究和开发。自70 年代以来,细胞培养用生物反应 器有了很大的发展一批现代化仪器已被用于细胞 培养的监测和控制, 培养的监测和控制, 如流式细胞光度计、电子显微 镜、核磁共振仪、质谱仪、高效液相色谱以及流 动注射分析等, 动注射分析等, 其中细胞培养过程的在线检测技术 是当今国外在此领域的研究热点。先进的自动控 制理论正逐步移植于细胞工程领域, 制理论正逐步移植于细胞工程领域, 预示着动物细 胞大规模培养技术正日臻成熟。
三、动物细胞培养技术的 基本理论
1、基本概念 2、动物细胞体外培养的增殖过程 3、动物细胞的培养方式
1、基本概念 所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞 在体外人工条件下的生长、增殖过程。在此 过程中, 过程中,细胞不再形成组织。由于动物细胞 培养是在人工条件下进行的, 培养是在人工条件下进行的,便于调控和观 察,因而成为现今研究动物的物质代谢过程、 染色体的形态变化、以及遗传物质的表达 调控等高难领域的既便利而又有效的新方 法。
1、在疫苗生产上的应用 疫苗是一种其主要成分具有免疫原性的蛋白 质。它是利用动物细胞大规模培养技术生产的最 成熟的一种产品。口蹄疫苗是用动物细胞大规模 培养方法生产的主要产品之一。1983年，英国 培养方法生产的主要产品之一。1983年，英国 Wellmme公司就已能够利用动物细胞进行大规模 Wellmme公司就已能够利用动物细胞进行大规模 培养生产口蹄疫苗。美国Cenentech公司应用SV40 培养生产口蹄疫苗。美国Cenentech公司应用SV40 为载体，将乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物 细胞内进行高效表达，以生产出乙型肝炎疫苗。 我国长春生物制品研究所研制的哺乳动物细胞疫 苗已完成了人体观察，通过了国家新药审批并进 行批量生产。
4、在干细胞体外诱导分化的应用 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细 胞。鉴于胚胎干细胞具有的全能性和由此带来的 潜在应用价值，目前胚胎干细胞已成为干细胞研 究热点。可以在细胞培养液中加入不同的分化因 子，定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞 或者神经细胞，甚至可以用它培养出器官。虽然 现今干细胞的众多工作多限于基础的研究阶段， 但其广阔应用前景显示了巨大的吸引力。首先， 利用干细胞培养可实现组织修复和器官再生。再 利用干细胞培养可实现组织修复和器官再生。再 者，结合克隆技术创建病人特异性的胚胎干细胞 可以克服移植免疫排斥反应。还可以用于基因治 可以克服移植免疫排斥反应。还可以用于基因治 疗。
3、单克隆抗体生产上的应用 单克隆抗体一经问世，就因其具有特异 性强和能够大量生产的特点而显示巨大的 生命力，目前，单克隆抗体在医药领域主 要是通过显示组织细胞的特异性抗原而用 于疾病诊断。在疾病治疗方面，单克隆抗 体如人体卫士，能识别自己和异己成分。 用于癌症治疗方面尤显特效。此外在农业 上也有良好应用前景。
动物细胞培养技术及 其在食品工业中应用
主要内容
动物细胞培养技术的发展史 动物细胞培养技术的实际应用与成就 动物细胞培养技术的基本理论 动物细胞培养技术在食品工业的应用 动物细胞培养技术存在问题和展望
一、动物细胞培养技术的发展史
动物细胞培养技术起源于19世纪的某些胚胎 动物细胞培养技术起源于19世纪的某些胚胎 技术。1885年，德国人W Roux把鸡胚髓板在温热 技术。1885年，德国人W Roux把鸡胚髓板在温热 的盐水中维持其存活了10天，被认为是组织体外 的盐水中维持其存活了10天，被认为是组织体外 培养的萌芽实验。直到到1907 培养的萌芽实验。直到到1907 年, 美国生物学家 Harrison在无菌条件下, Harrison在无菌条件下, 以淋巴液为培养基成功地 在试管中培养了蛙胚神经组织达数周, 在试管中培养了蛙胚神经组织达数周, 创立了体外 组织培养法。在随后的近一个世纪里, 组织培养法。在随后的近一个世纪里, 随着细胞生 物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和 完善, 完善, 动物细胞培养技术得到了很大的发展。其发 展简史见下表。
2、动物细胞体外培养的增殖过程 细胞生命周期性变化 a 潜伏期： 细胞从接种到适应新环境生长繁殖 潜伏期： 的一段时间,此间细胞胞质回缩, 的一段时间,此间细胞胞质回缩,代谢缓慢。 b 指数生长期：指数生长期是细胞活力最好的 指数生长期：指数生长期是细胞活力最好的 时期, 时期,细胞增殖旺盛。 c 稳定期：培养空间和营养物质有限，且代谢 稳定期：培养空间和营养物质有限，且代谢 废物积累，新分裂细胞数与死亡细胞数相等，细 胞总数不变，但代谢活动仍在进行。 d 衰亡期：营养物耗尽，有害物作用，死亡数 衰亡期：营养物耗尽，有害物作用，死亡数 大于分裂数。
四、动物细胞培养技术在食品工业 的应用
动物细胞工程的应用主要是指利用动 物细胞大规模培养技术生产植物和微生物 难于生产的具有特殊功能的蛋白质类物质。 已实现商业化的产品有口蹄疫苗、狂犬疫 苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、牛白血病病毒 疫苗、a 干扰素及B 疫苗、a-干扰素及B-干扰素、血纤维蛋白溶 酶原激活剂等等，及200种单克隆抗体等。 酶原激活剂等等，及200种单克隆抗体等。
2、在干扰素生产上的应用 干扰素是一种在同种细胞上具有广谱 抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥受细 胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白 胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白 质的合成。干扰素分子只具有抑制病毒的 作用而不能杀灭病毒。其机制是：当干扰 素作用于细胞后，是细胞产生多种其他蛋 白质，从而阻断病毒的复制过程。英国 Wellmme公司为满足临床试验的需求，采用 Wellmme公司为满足临床试验的需求，采用 8000L Namalwa细胞生产a-干扰素。Celltech Namalwa细胞生产a 干扰素。Celltech 公司用气升式生物反应器生产a 干扰素、B 公司用气升式生物反应器生产a-干扰素、B干扰素、r 干扰素、r-干扰素。
a 空心纤维法:最初使用的空心纤维是一种由醋 空心纤维法: 酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜, 酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜, 能 使水分子、营养物质和气体透过, 使水分子、营养物质和气体透过,也能使细胞在上 面贴附生长, 面贴附生长,培养时将待培养细胞接种于空心纤维 的外腔,培养一段时间后, 的外腔,培养一段时间后, 逐渐用无血清培养液代 替含血清培养液。此时细胞虽不再增殖, 替含血清培养液。此时细胞虽不再增殖,但能正常 生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。 由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便, 由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便, 因而在生产激素和单抗时被广泛应用。并相继开 发出了由硅胶、聚砜、聚丙烯等材化技术 细胞培养中目前最令人振奋的进展之一 是采用了微载体(M icrocarrier,MC)。微囊化 是采用了微载体(M icrocarrier,MC)。微囊化 培养有一些突出的优点。首先, 培养有一些突出的优点。首先, 细胞能生长 和维持在小体积的培养液中, 和维持在小体积的培养液中, 这使培养液中 的分泌产物变浓, 简化了下游加工。其次, 的分泌产物变浓, 简化了下游加工。其次, 培 养液易于迅速改变, 养液易于迅速改变, 且无分离细胞与培养液 的困难。最后, 的困难。最后, 微囊固定化细胞较少暴露于 物理损伤环境。目前, 物理损伤环境。目前, 微囊工艺已用于生产 以克计的单克隆抗体。高表达有工业价值 蛋白质的重组细胞近年来亦更多地用微囊 化培养。