分子生物学实验设计田益夫（2013141241072）唐子林（2013141241127）（一）实验目的获得发绿色荧光的细菌。

（二）实验概述通过体外扩增目的基因eGFP并构建表达载体pET-28a-eGFP转入大肠杆菌BL21，涂板观察细菌中外源绿色荧光蛋白基因表达情况。

（三）实验步骤及材料1 实验准备与质粒提取1.1 实验材料及试剂含有pEGFP-N3质粒的大肠杆菌菌液和含有pET-28a质粒的大肠杆菌菌液（或pEGFP-N3质粒、pET-28a质粒及E.coli DH5α）；胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水，1N NaOH；溶液I, 溶液II, 溶液III;卡那霉素储存液（50mg/ml），工作浓度50μg/ml;氨苄青霉素储存液（100mg/ml）,工作浓度100μg/ml；饱和酚，氯仿，异戊醇；无水乙醇，含RNase的双蒸水。

1.2 实验仪器恒温摇床，超净工作台，高温灭菌锅，10、200、1000μl移液器各一支及对应枪头各一盒，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器，EP管，三角瓶等常用玻璃仪器，琼脂糖凝胶电泳仪等。

1.4实验具体步骤1.4.1 仪器准备与培养基的配置（1）取两个250ml锥形瓶，各配置100ml固体/液体LB培养基，（2）按照体系将以上物品分别加入两个烧杯中，加入80ml去离子水混匀溶解。

加入琼脂的培养基在石棉网上加热溶解。

（3）用1N NaOH调节PH至7.5，倒入250ml锥形瓶中，与装好的平板一起放入高温灭菌锅内121℃灭菌20min。

（4）将包好的平板，枪头（10、100、1000μl），EP管，三角瓶等常用仪器放入高温灭菌锅内121℃灭菌30min。

（5）将灭菌后的常用仪器放置于干热灭菌箱内保存备用。

（6）取一支200μl移液枪，200μl枪头一盒，灭菌后的培养基、灭菌后的平板等放于紫外灯下照射30min。

（7）待培养基降温至50℃左右，各加入Kana霉素10μl。

（8）倒5个平板于4℃冰箱储存备用。

1.4.2 扩大培养及菌保（1）取两个已经灭菌的50ml三角瓶，配好的LB(Kana)培养基，移液枪和一盒枪头（100μl）放入超净台中紫外灯下照射30min。

（2）向两个50ml三角瓶中分别加入已配好的约10mlLB（Kana）液体培养基，再用移液枪分别移取10μl带有pEGFP-N3质粒的菌液和10μl带有pET-28a质粒的菌液于恒温摇床上37℃、220rpm过夜培养。

（3）取已高温灭菌的EP管，LB（Kana）液体培养基，1000μl 枪头和移液枪，甘油于紫外灯下照射30min。

（4）向6个EP管（每种菌做3管甘油菌保存）各中加入800μl 摇好的菌液（呈浑浊）和200μl甘油配置20%的甘油菌于-20℃下菌保。

1.4.3 碱裂解法提取质粒（1）取1.5ml菌液于1.5mlEP管中，10000rpm x 2min，弃去上清液，重复一次，弃去上清液。

（2）加入100μl溶液I，漩涡器上充分混匀，室温下放置10min。

（3）配制70%乙醇，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）和氯仿/异戊醇（24：1）备用。

（4）向（2）中加入200μl新制溶液II，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min。

（5）加入150μl预冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次使之混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min。

（6）10000rpm x 5min，取上清液于另一干净离心管中。

（7）向上清液中加入等体积（约400μl）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，（10000rpm x 10min），将上清液转移至新的离心管中。

（8）加入等体积（约370μl）氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心2min，取上清液于新离心管中。

（9）向上清液中加入其2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

（10）12000rpm x 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

（11）加0.8ml 70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或温室自然干燥30min。

（12）加入20μl含RNase的双蒸水，-20℃保存备用。

1.4.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定（1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mlxTAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。

（2）待胶液冷却至65℃，加入1μlGold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡。

（3）缓慢倒入事先准备好的制胶有机玻璃槽（插入样品模版梳子）内。

静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。

（4）胶板放入电泳槽中（样孔位于负极），注入1xTAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μl与1μl Loading Buffer (6x)混匀，加入胶板上的样品孔内。

（5）将电泳槽于电泳仪接通，调节电压为100v左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

（6）将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

2 质粒酶切与连接2.1 酶切位点分析和引物设计2.1.1通过PCR扩增获得目的片段的方法：EGFP基因序列：ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTG GACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCC ACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCC TGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAG GAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAG TTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAG GACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTAT ATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC ATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGC GACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGC AAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCC GGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG TAAEGFP酶切位点分析：（http://users.unimi.it/camelot/tools/cut2.html）The following endonucleases were selected but don't cut this：sequence:………………NgoAIV, NgoMI, ……………… VspI, XbaI,选用引物：（用于后续菌落PCR检测等）F-P1: 5’’R-P2:5’’Xho l2.1.2通过直接没切质粒获得目的片段的方法：实验方案分析:在左图质粒EGFP 基因前的多克隆位点（MCS ）上有酶切位点BamHI, 而在EGFP 基因末尾有一个NotI 酶切位点；在质粒pET-28a 的MCS 上也含有这两个酶切位点，因此可以直接酶切更方便地从质粒上酶切获得目的片段再进行连接构建表达载体pET-28a-EGFP 。

2.2 实验材料及试剂pEGFP-T1质粒模板, 双蒸水，10 x Buffer, MgCl2, 移液枪及枪头，4xdNTP, 正向引物，反向引物，Taq 酶， 0.2ml EP 管，一次性手套，凝胶成像系统，恒温培养箱。

2.3 实验仪器台式高速离心机，PCR 仪，琼脂糖凝胶电泳仪。

2.4 实验流程2.5 实验步骤2.5.1 PCR 扩增目的片段（1）取一个0.2mlEP 管配制50μlPCR 反应体系反应物 ddH2O 10xBufferMgCl2 4xdNTP 正向引物 反向引物Taq 酶 质粒模板体积（μl345321113（2）混匀后瞬时离心PCR 扩增目的基因片段 对pEGFP-N3进行酶切回收 对pET-28a 进行酶切回收电泳检测目的片段确实存在将回收产物进行连接（3）放入PCR仪中，设置反应程序：①94℃预变性5min。

②94℃变性30s。

③55℃退火30s。

④72℃延伸60s。

⑤重复②~④30次。

⑥72℃延伸10min。

（4）取5μl反应液加入1μl 10x loading buffer做电泳检测，分析所的片段大小，确定EGFP确实存在于质粒中。

2.5.2 酶切获得目的片段（1）分别取两支0.2mlEP管做好记号：如①②（3）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。

（4）取5μl①②EP管酶切反应液，同时取5μl原质粒溶液做对照，进行电泳检测酶切结果。

（5）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。

2.5.3 DNA连接重组（2）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应20min，-20℃保存用于转化。

3 转化E.coli DH5α扩增质粒并提取转化BL213.1实验材料及试剂感受态大肠杆菌DH5α，LB(Kana)固体培养基，DNA模板，4xdNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，Marker DNA, 10xBuffer , 15mmol/l MgCl2，感受态大肠杆菌BL21，碱裂解法提取质粒的试剂等。

3.2 实验仪器碎冰机，水浴锅，高速台式离心机，恒温摇床，PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，移液枪及枪头,碱裂解法提取质粒的仪器等。

3.3 实验流程3.4 实验步骤3.4.1 热击转化大肠杆菌（1）取出感受态细胞DH5α让其在冰上自然融化，每200μl 解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。

（2）42℃热击90s，立即置于冰浴5min。

（3）在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。

（4）6000rpm x 3min，去掉上清液（约留下200μl培养液），摇匀菌块。

（5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜。