动物疫病防控技术操作规范一、采血（一）鸡翅静脉采血操作步骤：（1）侧卧保定，睁开翅膀，露出腋窝部，拔掉羽毛，在翅下静脉处消毒。

先用碘酊（即 2%碘酒），再用 75%酒精脱碘，采纳点状螺旋式消毒。

（2）拇指压逼近心端，待血管怒张后，用装有细针头的注射器，平行刺入静脉，放松对近心端的按压，慢慢抽取血液，采血量许多于2ml。

（3）采血完成实时用干棉球压迫采血处止血，防止形成淤血块。

（二）鸡心脏采血操作步骤：（1）雏鸡心脏采血：选定采血部位先用碘酊（即 2%碘酒），再用 75% 酒精脱碘，以点状螺旋式消毒；左手抓鸡，右手手持采血针，平行颈椎从胸腔前口插入，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针，采血量许多于 2ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。

（2）成年禽类心脏采血：成年禽类采血可取侧卧或仰卧保定。

侧卧保定采血：助手抓住禽两翅及两腿，右边卧保定，在涉及心搏动显然处，或胸骨脊前端至背手下凹处连线的 1/2 处消毒（先用 2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒），垂直或稍向前面刺入2～3 厘米，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针，采血量许多于2ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。

仰卧保定采血：胸骨向上，用手指压离嗉囊，露出胸前口，消毒术部（先用 2%碘酒，再用 75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒），用装有长针头的注射器，将针头沿其锁骨俯角刺入，顺着体中线方向水平穿行，直到刺入心脏，采血量许多于 2ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。

注意事项：（1）确安心脏部位，切忌将针头刺入肺脏。

（2）顺着心脏的跳动频次抽取血液，切忌抽血过快。

（三）猪耳静脉采血操作步骤：（1）将猪站立或横卧保定，或用保定用具保定。

（2）耳静脉局部消毒（先用 2%碘酒，再用 75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒）。

（3）用手指捏压耳根部静脉血管处，使静脉充盈、怒张 ( 或用酒精棉频频局部涂擦以惹起其充血 )（4）术者用左手把持耳朵，将其托平并使采血部位稍高（5）右手持连结针头的采血器，沿静脉管使针头与皮肤呈 30°～45°角，刺入皮肤及血管内，轻轻回抽针芯，若有回血即证明已刺入血管，再将针管放平并沿血管稍向前伸入，抽取血液许多于 1ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。

（四）猪前腔静脉采血操作步骤：（1）仰卧保定，把前肢向后方拉直；（2）选用胸骨端与耳基部的连线上胸骨端旁 2cm的凹陷处，消毒（先用2%碘酒，再用 75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒）；（3）用装有 20 号针头的注射器刺入消毒部位，针刺方向为向后内方与地面呈 60°角刺入 2～3cm，当进入约 2cm时可一边刺入一边回抽针管内芯；刺入血管时即可见血进入管内，采血量许多于５ ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。

（五）牛颈静脉采血操作步骤：（1）保定好动物，使其头部稍前伸并稍倾向对侧；（2）对颈静脉局部进行剪毛、消毒（先用 2%碘酒，再用 75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒）；（3）看清颈静脉后，采血者用左手拇指 ( 或食指与中指 ) 在采血部位稍下方 ( 近心端 ) 压迫静脉血管，使之充盈、怒张；（4）右手持采血针头，沿颈静脉沟与皮肤呈 45°角，快速刺入皮肤及血管内，如见回血，即证明已刺入；使针头后端凑近皮肤，以减小此间的角度，近似平行地将针头再伸入血管内1～2 厘米；（5）松开压迫脉管的左手，采集血液５ ml。

采完后，以干棉球压迫局部并拔出针头，再以 5％碘酊进行局部消毒。

（六）牛尾静脉采血操作步骤：1、采血者左手抓住牛尾巴往上翘，手离尾根部约30 厘米。

2 在离尾根 10 厘米左右中点凹陷处，先消毒（先用2%碘酒，再用 75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒），而后用注射器针头垂直刺入（约 1 厘米深。

）3 针头涉及尾骨后再退出 1 毫米进行抽血。

4 采血量许多于５ ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。

注意事项：牛尾静脉与牛尾中动脉的解剖部位在牛尾腹侧中线处并行，浅部位的为尾静脉，深部的为尾中动脉。

进行牛尾采血的详细部位为离尾根 10 厘米左右，第 4、5 尾椎骨交界中点凹陷处，静脉血颜色暗、量少，动脉血颜色鲜红、量多。

二、鸡体解剖与采样操作步骤及次序以下：1、将鸡不放血致死；2、将处死鸡浸于消毒水中使羽毛浸润，洗去尘垢、污物；3、先将腹壁和大腿内侧的皮肤切开，使劲将大腿按下，使髋关节脱臼，将两大腿向外睁开，进而固定尸体；4、再于胸骨尾端后方将皮肤横切，与双侧大腿的竖切口连结，而后将胸骨尾端后方的皮肤拉起，向前使劲剥离到头部，使整个胸腹及颈部的皮下组织和肌肉充足裸露；5、而后在胸骨后腹部横切穿透腹壁，从腹壁双侧沿肋骨头关节处向前方剪断肋骨和胸肌，而后握住胸骨使劲向上向前翻拉，去掉胸骨露出体腔；6、对剪刀和镊子消毒；7、采集肺脏；8、对剪刀和镊子消毒；9、采集；肝脏10、对剪刀和镊子消毒；11、采集；脾脏12、对剪刀和镊子消毒；13、采集肾脏；14、从口腔下剪，剪开颈部皮肤肌肉，使喉头裸露；15、对剪刀和镊子消毒；16、采集喉头、气管；17、剪开头部皮肤，翻开头骨；18、对剪刀和镊子消毒；19、采集脑。

注意：采集样品时剪刀和镊子的消毒采纳火焰消毒法。

三、牛羊Ｏ -P 液采集牛羊Ｏ -P 液指牛羊食道 - 咽部分泌物，被检动物在采样前禁食（可饮少量水） 12h，免得胃内容物返流污染Ｏ-P 液。

操作步骤1、采样探杯在使用前经 0.2%柠檬酸或 1%～2%氢氧化钠溶液浸泡 5 分钟，再用与动物体温一致的清水冲刷后使用。

２、采样时动物应站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm 处（食道和咽部的联合处），轻轻往返抽动2～3 次，而后将探杯拉出。

３、拿出 5～ 8mlＯ -P 液倒入含有等量细胞培育液（0.5%水解乳蛋白-Earle液）或磷酸缓冲液（0.04%摩/升、PH7.4）的灭菌广口瓶中，充分摇匀加盖封口。

４、采完一头动物，探杯要按步骤２从头进行消毒并充足冲刷。

５、采集的样品放冷藏箱实时送检，未能实时送检应置 - 30℃冷冻保留。

四、血凝试验利用血凝试验考证64 单位抗原。

（一）操作步骤：1、在 96 孔 V 型微量反响板的1-8 排的 1-10 孔均加入 25 微升生理盐水稀释液，换 Tip 头（此中第 10 孔设为空白比较）；2、汲取 25 微升已配制好的64 单位抗原加入每排的第一孔中，混匀；3、从第 1 孔中汲取 25 微升混淆液加入第 2 孔，混匀后汲取 25 微升加入第3 孔，这样倍比稀释至第 9 孔，从第 9 孔吸出 25 微升弃去，换 Tip 头；4、每孔再加入25 微升生理盐水，换Tip 头；5、每孔均加入25 微升体积分数为1%鸡红细胞悬液（已配制好的），将鸡红细胞悬液充足摇匀后加入；6、振荡混匀，在室温（20- 25℃）下静置 40 分钟后察看结果。

（二）结果判断（比赛时由评委一致判断）：将微量反响板倾斜，察看红细胞有无成泪滴状流淌。

完整血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位。

比较孔（第 10 孔）红细胞呈显然的纽扣状沉到孔底（即不凝聚）则试验建立；假如64 单位抗原配制正确而且血凝试验操作正确，那么应当在每排的前 6 孔（ 64=26）出现完整凝聚而第7、8、9 孔则不出现凝聚。

7 排（含 7 排）以上结果正确为合格。

五、 ELISA 试验依照标准为《猪伪狂犬病免疫酶试验方法》NY/T678-2003，采纳 IDEXX 生产的猪伪狂犬病毒gpⅠELISA 抗体检测试剂盒。

（一）样品稀释用样品稀释液将被查验样品、阳性和阴性比较稀释 2 倍（比如： 60μL 样品稀释液中加60μ L 待检血清）。

（二）操作步骤使用前全部试剂应恢复至室温。

试剂应轻轻旋转或震荡予以混淆。

1、拿出抗原包被板，并将样品地点正确记录在记录表上。

2、向A1、B1 和C1 孔中分别加入100μL 稀释好的阴性比较，D1、E1孔中分别加入100μL 稀释好的阳性比较，在其他的孔内加入100 μL 已稀释好的被检血清。

3、室温下孵育 1 小时或 2～7℃孵育留宿（能够将微量反响板用封条封闭）。

4、在洗板机上用配制好的清洗液清洗板孔，重复3～5次。

注意应防止包被板孔干燥。

5、每孔加入 100μ L 辣根过氧化物酶标志抗PRVgpI 抗体。

室温下孵育20分钟。

6、重复步骤 4。

7、每孔加入 100μLTMB底物液，室温下孵育15 分钟。

8、每孔加入 50μL 停止液，使反响停止。

立刻用酶标仪于650nm测定各孔吸光度（ OD）值。

（三）结果判断1、阴性比较 OD值的均匀值减去阳性比较OD值的均匀值一定大于或等于 0.3 ，试验方能有效。

假如试验无效，应重做。

2、待检样品能否含有针对gE 抗原的抗体取决于每个样品的S/N 值，S/N 等于样品 OD值除以阴性比较OD均值。

3、假如样品的S/N 值小于或等于0.60 ，样品应判断为PRVgpI 抗体阳性。

4、假如 S/N 值大于 0.60 但小于或等于0.70 ，样品应重测。

假如试验结果不变，三周后应从头采样检测。

5、假如 S/N 值大于 0.70 ，样品应判断为PRVgpI 抗体阴性。

（四）注意事项1、全部试剂应在2～7℃储藏，使用前恢复到室温，使用后放回 2～7℃。

2、不要使用超出有效限期的试剂，不一样批次试剂盒的成分不得混用，使用试剂时应防备试剂污染。

3、TMB底物和停止液对皮肤有刺激性。

4、TMB不要裸露于强光和任何氧化剂，使用干净的玻璃或塑料容器盛装 TMB底物液。

5、包被板拆封后防止受潮或沾水（未用的包被板放于加干燥剂自封袋中，应赶快置于4℃）。

6、在操作过程中移液时，切忌将气泡加入检测板孔中。

7、全部的荒弃液应在抛弃前合理办理免得污染环境。

六、细菌镜检操作步骤：1、翻开显微镜电源开关；2、把镜筒上涨约 1.5 厘米，再把油镜转到工作地点；3、在细菌涂片上所要察看的地点滴一小滴香柏油，放入载物台上并将标本移到适合地点；4、仔细拧动粗调焦螺旋，使镜筒慢慢降落。

这时要认真察看物镜前端与标本之间的距离，先使物镜前端与油滴接触，而后再慢慢降落镜筒，至物镜前端凑近而没有遇到玻片为止。

这步操作要特别当心，防备油镜压碎标本或破坏油镜。

5、眼睛看目镜中，拧动细调焦螺旋，使镜筒慢慢上涨到能看清标本。

这步操作要特别注意不要把细调焦螺旋的方向拧错，以防压碎标本。

6、察看并记录结果。

7、察看后，提高镜筒约 1 厘米，改换标本片；8、察看完成后，提高镜筒约 1 厘米，取下标本片，把油镜转离光轴，封闭电源，实时做洁净工作。

先用干的擦镜纸擦一、二次，把大多数油去掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦两次，最后再用干擦镜纸擦一次。

擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。