微生物实验报告
细菌的革兰氏染色及形态观察
一、目的要求：
1、熟悉光学显微镜的使用方法。

2、掌握革兰氏染色法。

3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征
二、器材和器皿：
1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌
2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯
3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等
三、实验原理：
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。

未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。

染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染色属复染法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。

四、实验步骤：
1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、涂片：
液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。

4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。

6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。

简单染色结束可观察细胞形态。

7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。

8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。

9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。

至此，革兰氏染色结束。

五、实验现象：
1、大肠杆菌：显微镜下革兰氏染色后大肠杆菌呈现红色，属于阴性菌。

两端钝圆的短小杆菌，周生鞭毛，无芽孢，能运动。

2、枯草芽孢杆菌：显微镜下革兰氏染色后枯草芽孢杆菌呈现紫色，属于阳性菌。

椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，无荚膜，周生鞭毛，能运动。

3、金黄色葡萄球菌：显微镜下革兰氏染色后金黄色葡萄球菌呈现紫色，属于阳性菌,排列葡萄球状,无芽胞,无荚膜。

六、思考题：
1、用油镜观察标本时应注意哪些问题？
答：（1）油不要滴太多
（2）在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离不要弄坏工具
（3）调节时应该从下往上调节
(4)在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。

（5）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。

如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。

在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。

（6）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

2、哪些因素会影响革兰氏染色结果的正确性？
答：菌龄、涂片厚薄均匀度、媒染时间、乙醇脱色程度，老化的细菌容易产生假阴性。

（2）酒精脱色时间过短造成假阳性，时间过长造成加阴性
3、在实验报告上画出在显微镜下观察到的三种细菌的形态结构。

姓名：黄鹏飞
班级：环境14325班
时间：2015.11.10。