胶回收基础知识 方法及应用
1. 分类
2. 应用
试剂耗材与设备
四 五
6
操作流程
常见问题解答
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2.1 分类
1
• 硅胶柱法
2
• 玻璃奶/纯化填料法
• 低熔点琼脂糖法 • 透析带电洗脱法 • DEAE纤维素膜纸片法
特别是大片断的回收。
9
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2.1.3 低熔点琼脂糖法

传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，
电泳后切割目的条带，在 TE 溶液中 65 ℃保温融化，
用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。

这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇

由于绑透析带很难操作，只有在回收非常大的片断时 才会考虑的。

丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。
11
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2.1.5 DEAE 纤维素膜纸片法

将 DEAE 纤维素膜裁成小条活化处理 。 电泳后 在目的条带前切一刀 ，将比条带略宽 的 DEAE 纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条 带上的 DNA 被膜片截留，取出膜片冲洗后转移 到离心管中加缓冲液 65 ℃保温洗脱，直到膜上 DNA 被完全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。
33
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4.2 注意事项
６ . 切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对
DNA 造成损伤。
7. 回收 <100bp 及 >10kb 的 DNA 片段时，应 加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。 8. 回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关，初 始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。
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5 常见问题解答
问题 可能原因 胶溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例 胶体积太大，可用枪头捣碎，若不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收 紫外灯下切胶时间过长，导致 DNA 部分降解，应尽量把切胶时间控制 在 30s 以内 用胶回收试剂 盒从凝胶中回 收 DNA 得率低 是什么原因？ 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率 TAE 电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致 pH 值升高，降低 DNA 和膜的吸 附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好 回收前的样品量太少，加大点样量 洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可 以有效提高回收率 30% 以上
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4.1 实验流程
1
2
3
将吸附柱CA2放回 收集管中
12000rpm, 离心2min
将吸附柱CA2置于 室温放置数分钟， 晾干
25
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4.1 实验流程
1
2
3
将吸附柱CA2放到 一个干净离心管中
8
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2.1.2 玻璃奶/纯化填料法

利用特殊玻璃微珠吸附
DNA 的 特 性 ， 根 据 每 次 回 收实验时预期回收量来调整
玻璃奶/纯化 填料法
纯化填料的量，使得实验不
受限于柱子的载量，也不会 造成浪费。

适合各种不同大小的片断，
1.2 胶回收原理

利用核酸在裂解 液下与硅胶膜吸
电泳后 ，切下凝胶 称重后，加入等体积溶胶液 上柱吸附DNA
附柱特异性结合，
在洗脱液条件下 被洗脱，从而达 到核酸纯化回收 的目的。
除胶 脱盐
洗脱
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4.1 实验流程
琼脂糖凝胶制作
上样
电泳
①
在锥形瓶中加入 1mL 50xTAE 、 49mL 蒸馏水、 0.4g 琼脂糖，混匀；
①
取 1μ L 上 样 缓 冲 液 与 5μ L 产 物混匀
电泳条件： 140V ， 20min 。
23
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4.1 实验流程
1
2
3
向吸附柱CA2中 加入μ L漂洗液PW
12000rpm, 离心30~60sec
弃废液，将吸附 柱重新放回收集管 中。重复操作1,2,3
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试剂耗材与设备
2. 耗材 3. 设备
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3.1 试剂
产品组成 平衡液BL（Buffer BL） 溶胶液PN（Buffer PN） 漂洗液PW（Buffer PW) 洗脱缓冲液EB（Buffer EB）
Lane M:1kb DNA Marker Lane 1: 胶回收前的 2.7kb DNA 段 Lane 2: 胶回收后的 2.7kb DNA 段 切割 Lane 1 后，经处理回收 DNA ，
切割 回收
经电泳得到 Lane 2 。
4
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早期实验室最常用方法之一。
这个方法不适合做较大的 DNA ，因为洗脱比较 困难。
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2.2 应用
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4.1 实验流程
1
2
3
将目的条带从 琼脂糖凝胶中 切下
放入干净的 离心管中
称取重量
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4.1 实验流程
1
2
向胶块中加入 等体积溶液PN
复澄清。
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4.2 注意事项
3. 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电
泳和回收效果。
4. 如下一步实验要求较高，则应尽量使用 TAE 电 泳缓冲液。 ５ . 如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测 pH 值，如 pH 值大于 7.5 ，可向含有 DNA 的胶溶液 中加 10~30 μ L3M 醋酸钠（ pH5.2) 将 pH 值调制 5~7 之间。
②
放入微波炉中加热，约煮沸三次，
冷却至不烫手；
③
加入 2.5 μ LNuclleic Acid Stain 核 酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，
②
垂直加入上样 孔中。
倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，
待凝固。
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4.2 结果分析 —琼脂糖凝胶电泳
1. 实验流程 2. 注意事项
四 五
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4.1 实验流程
1
2
3
向吸附柱CA2柱 加入500μ L 平衡液BL
12000rpm, 离心1min
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
20
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50℃水浴，不 断温和地上下翻 转离心管，确保 胶块充分溶胶。
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4.1 实验流程
1
2
3
将所得溶液加入 一个吸附柱CA2中， 室温放置2min
12000rpm, 离心30~60sec
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
向吸附膜中间 位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液EB， 室温放置2min
12000rpm, 离心2min 收集DNA溶液
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4.1 实验流程
原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。
3
4
5
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2.1.1 硅胶柱法

采用可以高效、专一结合 DNA 的硅基质材料和