蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
2.2静态吸附和洗涤①静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。
吸附结束，吸取 200μL上清于dorf 管中、4度保存备用（标记“1”），倾倒上清。
②洗涤杂质：取与树脂体积相当的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约5min，重复2次，每次洗涤后，吸取 200μL 洗涤液于 dorf管中、4度保存备用（标记“2”“3”），倾去洗涤液。
2.3动态洗脱①用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T档调“100”，A档调“0”），开始用 50mM NaCl洗脱液恒速洗脱杂质。
（流速约2~3mL/min)。
②洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后每隔2min，记录下吸光值和电导率值（使用LP层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。
在洗脱峰吸光值最大处收集少量洗脱液于 dorf管中，标记“4”）③收集溶菌酶：更换 500mM NaCl洗脱液，同样记录，同样在吸光值最大处收集少量洗脱液于dorf管中，标记“5”），不同的是，此时是溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，4度保存。
2.4再生树脂、洗涤管道、绘制层析图谱用0.5M NaOH溶液（约1倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。
管道系统连接好，用约100mL 70%乙醇冲洗管道，冲洗层析柱。
以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，使用LP层析系统的同学，分别以吸光值和电导率为纵坐标。
3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶实验材料：溶液：0.5M NaOH溶液透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）其他材料：透析袋（8000~10000Da），超滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。
3.1超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口压力不超过2.0bar），收集透过液，回流液（吸取200μL于dorf管中，标记为“6”），当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结束。
3.2盐析在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为35％（即100mL 溶液中 35g 硫酸铵），室温下静置约20~30min，4度、10000rpm、20min。
3.3透析除盐取少量 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的0.1M 磷酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲液继续透析24h。
透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。
4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量实验材料：制胶的试剂：30％胶贮存液：丙烯酰胺（Acr）：甲叉双丙烯酰胺（Bis)＝ 29：1避光保存神经毒加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）剧毒催化剂：10％过硫酸铵（AP ）新鲜配制变性剂：10％SDS 室温保存缓冲液：2×样品缓冲液： 100mmol/L Tris-HCl 4%SDS 0.2%溴酚蓝 20%甘油200 mmol/Lβ-巯基乙醇 pH6.8凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCl pH 8.8，0.5M Tris-HCl pH6.810×电泳缓冲液：250mmol/L Tris-HCl 2.5 mmol/L 甘氨酸 1% SDS pH8.3 4度保存染色液：考马氏亮蓝 R250 染色液仪器：垂直电泳系统4.1配制分离胶12％各种溶液在洁净干燥的烧杯中混合均匀，勿使胶液产生大量气泡，迅速沿玻璃板边缘加入胶液，至短板约2/3高处，灌注胶液时避免混入气泡，迅速加入去离子水至短板顶端，覆盖住胶面，待凝胶聚合，倒去水层，并用滤纸将水分吸干。
4.2配制浓缩胶5％迅速沿玻璃板边缘加入胶液至接近顶部，斜插入“梳子”，确保“梳齿”底端无气泡，和“梳子”水平。
4.3加入1×电泳缓冲液加入约200mL 1×电泳缓冲液，使凝胶上、下端都浸泡在电泳缓冲液中，并且内槽缓冲液高于外槽；确保加样孔内无无气泡，以保证电流畅通。
4.4制备样品（1）将15μL样品与15μL 2×样品缓冲液在dorf管中混合均匀，100度煮沸5min，8000rpm 离心 5min；（2）样品（从左至右）①蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）②标记“1”（吸附后的上清液）③标记“2”（洗涤后的上清液）④标记“3”（50mM NaCl洗脱峰）⑤标记“4”（500mM NaCl洗脱峰）⑥标记“5”（超滤回流液）⑦标记“6”（透析除盐后的溶菌酶样品）⑧蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）加样：用移液枪缓慢地加入 30μL 样品于样品孔中，让样品沉于样品孔内，避免加入气泡。
4.5电泳（1）恒压电泳 100V；（2）当溴酚蓝迁移至凝胶底部约0.5cm处，停止电泳；（3）小心剥离凝胶，将凝胶浸入考马斯亮蓝 R250染液中，浸泡过夜；（4）第二天回收染色液，用脱色液均匀脱去凝胶上的剩余染液。
注意事项：染色和脱色都应该均匀，所以如果条件允许，应在脱色摇床上进行。
4.6马氏亮蓝R250染色原理：考马氏亮蓝R250通过范德华力与蛋白质结合，适用于蛋白质电泳微量蛋白质染色，当蛋白质浓度超过一定范围时，对其染色不符合Beer定律，不适合作定量分析。
灵敏度：每一条蛋白质条带最低质量为0.1μg。
实验结果与分析1.柱层析前的准备工作经碱－酸－碱的方法（Na型）预处理724型阳离子交换树脂后进行装柱，然后用配制的0.1M磷酸钠缓冲液平衡离子交换树脂，经1L磷酸钠缓冲液的平衡之后，树脂仍没有平衡完全，流出来的缓冲液的pH仍过碱。
讨论：可能由于在碱酸碱预处理过程中洗涤碱液不完全，造成树脂平衡缓慢。
所以配制新的缓冲液继续进行平衡树脂操作，经约500ml缓冲液流过后。
树脂平衡完全，可进行下步操作。
2.柱层析法提取溶菌酶按照实验步骤进行溶菌酶的静态吸附和杂质洗涤后，按实验步骤进行动态洗脱操作。
得到63组实验数据。
以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱。
如下：通过层析图谱可知，在22分钟起进入溶菌酶洗脱峰，收集洗脱出来的溶菌酶。
4度保存。
3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶提取出的粗溶菌酶经过超滤分离、盐析、透析除盐等操作，透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。
4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量保存的各管样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、马氏亮蓝R250染色后进行脱色，处理后得到含条带的凝胶。
对电泳条带进行分析：因在洗脱溶菌酶时本组在洗脱峰中多收集了两个dorf管的洗脱液，所以本组有8只dorf管的样品，7号管为析袋内的溶菌酶样品。
由电泳条带可知，7号条带只有一条，所以7号管内的溶菌酶样品比较纯净。
另，由于在制胶过程中，拔去梳子过程中造成了9号孔和10号孔上部脸在了一起，从而导致点样时，9,10号点样孔内的样品有混合现象，造成了一定的实验失误。