无菌操作泛指在培养微生物的操作中， 所有防止杂菌污染的方法。
成功地培养微生物的关键。
大肠杆菌的培养实验与分离
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
（１）消毒定义：
是指杀灭病原微生物的方法。
（2）灭菌的定义：
是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子） 的方法
3.常用的消毒与灭菌的方法
大肠杆菌的Байду номын сангаас养实验与分离
大肠杆菌的培养实验与分离
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划 线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
病毒
病毒界
细菌 微生物包括哪五类： 放线菌
原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用 光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细 胞结构.且体内一般大不肠杆含菌的有培养叶实验与绿分离素.不能进行光合作用.
(二)细菌的常识
1、结构
2、分裂
3、生殖 4、变异类型 5、在基因工程中的
2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌； 桌面及人手用酒精棉球消毒
3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三 角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁 操作.
4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌 大肠杆菌的培养实验与分离
细菌的革兰氏染色
革兰氏染色法是一种用于细菌的染 色法。此法将细菌分为两类，即革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰 氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后， 再用脱色液处理，细菌仍保留染色液 的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两 种菌的差别在于细胞壁的成分不同。
第一部分 :微生物的应用
实验1 大肠杆菌的培养与分离
大肠杆菌的培养实验与分离
实验目的:
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养 基进行细菌培养的操作 2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培 养基进行细菌的划线培养 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求 的原理
大肠杆菌的培养实验与分离
一、基础知识： (一)微生物：是一切肉眼看不见或看不清 楚的微小生物的总称．
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
大肠杆菌的培养实验与分离
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
应用
大肠杆菌的培养实验与分离
大肠杆菌
大肠杆菌的培养实验与分离
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌 大肠杆菌的培养实验与分离
细菌的营养类型
• 根据细菌所利用的能源和碳源的不同 将细菌分为两大营养类型。
• 自养菌:
光能自养型:光合细菌
化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌
• 异养菌:
腐生菌
寄生菌
大部分病原菌
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气 又不使菌进入
大肠杆菌的培养实验与分离
（二）倒平板
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后 立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部， 待凝，使之形成平面
大肠杆菌的培养实验与分离
注意事项： 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来 倒平板
分离方法:划线分离法和涂布分离法
大肠杆菌的培养实验与分离
1、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的 平板上连续划线.
大肠杆菌的培养实验与分离
平板划线的操作
大肠杆菌的培养实验与分离
不能使用脱 脂棉，否则 容易吸水， 造成污染。
大肠杆菌的培养实验与分离
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，大会肠杆菌形的培成养实一验与个分离条状的菌落。
灭菌的方法： 1、灼烧灭菌
大肠杆菌的培养实验与分离
2、干热灭菌： 160-170 ℃下加热 1-2h。
3、高压蒸气灭菌： 100kPa、121 ℃下 维持15-30min.
大肠杆菌的培养实验与分离
1
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他 外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌
大肠杆菌的培养实验与分离
(三)细菌的培养 ☆ 培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制 而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养液。
1.培养基的类型
固体培养基和液体培养基、半固体培养基。 成分区别：琼脂
大肠杆菌的培养实验与分离
2.不同的微生物往往需要采用不同的 培养基配方
大肠杆菌的培养实验与分离
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。 注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
大肠杆菌的培养实验与分离
（四）大肠杆菌的划线分离
大肠杆菌的培养实验与分离
☆ 菌落 • 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖
时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 • 菌落是鉴定菌种的重要依据。
大肠杆菌的培养实验与分离
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
大肠杆菌的培养实验与分离
沉淀生长
☆ 无菌技术 1.无菌技术的概念
细菌喜荤，霉菌喜素
大肠杆菌配方：酵母提取物 0.5g 蛋白胨 0.5g Nacl 0.5g 琼脂 1g 水:50ml
3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳 源、和氮源、 无机盐、生长因子等营养 物质，另外还需要满足微生物生长对 pH 、氧气、渗透压的要求．
大肠杆菌的培养实验与分离
4.培养基的用途
液体培养基：扩增细菌、工业生产 固体培养基：纯化（分离），鉴定、保 藏菌种