收稿日期:2002-03-09 基金项目:华南师范大学博士启动基金资助项目(98008) 作者简介:文丽君(1975-),女,湖南衡东人,2000级硕士研究生,研究方向为有机材料合成.第15卷第3Π4期2002年7月海南师范学院学报(自然科学版)JOURNA L OF H AI NAN NORM A L UNI VERSITY (NAT URA L SCIE NCE )V ol .15　N o .3Π4July 2002文章编号:1671-8747(2002)04-0209-05质谱技术的新进展及其在生命科学中的应用文丽君,曾　志,杨定乔(华南师范大学化学系,广东广州510631)摘　要:文章综述了质谱技术的新进展与CZE ΠMS ΠMS ,M A LDI -T OF -MS ,LC -ESI -MS 等质谱新技术及它们在生命科学中的应用.指出这些质谱新技术已被证明在多肽和蛋白质的鉴定、单核苷酸、核酸、糖蛋白的分析等领域是很有效的工具.关键词:CZE ΠMS ΠMS;M A LDI -T OF -MS;LC -ESI -MS;生物分子结构鉴定;生物分子序列分析中图分类号:O657114 文献标识码:A近年来,一系列质谱软电离技术得到了新的发展.这些软电离技术包括电喷雾电离(Elec 2trospray I onization ESI )[1]和基质辅助激光解吸电离(Matrix -assisted Laser Des orption ΠionizationM A LDI )[2]等.它们的发展不但使质谱技术发生了突破性的革新,而且使质谱技术在生命科学中的应用得到了前所未有的扩展.质谱技术所能提供的精确分子量和分子结构信息及其微量鉴定的特点,使它成为蛋白质组研究中两大支撑技术之一.其中电喷雾质谱由于其易于与常规的高分辨率分离方法如高效液相色谱和毛细管电泳等实现在线连用而在多肽混合物的分析中得到了广泛的应用;因为在多肽混合物的高灵敏度分析中,将多肽与其它杂质分离对于获得准确的分析结果至关重要.最近,毛细管电泳Π质谱联用方法(CE ΠMS )得到了新的发展,已被成功地应用于多肽和蛋白质的鉴定中.一些微量电喷雾技术如微升电喷雾(microspray )技术和纳升电喷雾(nanospray )技术以及相应的CE ΠMS [3]接口技术和具有极高灵敏度的质谱仪如傅立叶转换离子回旋共振质谱仪(FTI -CR -MS )的研制已使得在阿托摩尔(10-18m ol ・L -1)水平上进行蛋白质鉴定成为可能[4].随着分子生物学和生物技术的迅猛发展以及核酸在生命科学研究中的重要位置,有关核酸的分子生物学已成为当前生命化学中最具活力的研究方向之一.化学合成和化学修饰的寡核苷酸已经在基因诊断方面显示出良好的应用前景.因此,建立和发展一种更有效,灵敏,快速和精确的寡核苷酸的结构和序列分析方法一直是生物化学家们研究的前沿之一.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术为此提供了新的途径.它不仅广泛地应用在多肽和蛋白质的质量分析上,能直接或间接测定生物试样样品中的肽和蛋白质离子[5],而且在对化学修饰的寡核苷酸及核酸片段的序列分析上也显示了良好的应用前景.液相色谱-质谱法,结合蛋白酶及专012海南师范学院学报(自然科学版) 2002年一性糖苷酶的酶解,可用来分析糖结合位点,糖链的组成和结构以及糖链的分支情况[6].1　毛细管区带电泳Π串联质谱联用法鉴定多肽和蛋白质随着质谱技术的发展,通过串联质谱测定蛋白质的多肽序列,并搜索数据库成为高通量鉴定蛋白质的新方法,用图论及真实谱-理论谱联配的方法对串联质谱得到多肽图谱进行从头解析.最近,有报道[7]用包层液接口实现毛细管电泳Π电喷雾质谱在线连用,对标准多肽混合物和蛋白酶解产物在低皮可摩尔水平上进行了串联质联质谱分析,建立了利用毛细管区带电泳Π串联质谱法(CZEΠMSΠMS)对多肽和蛋白质进行高灵敏度鉴定的方法,并通过数据库来搜寻鉴定蛋白质.毛细管电泳Π电喷雾质谱在线连用:毛细管区带电泳在Beckman pΠACE system5500型毛细管电泳仪上进行.为了保证稳定的喷雾过程,CEΠMS接口处的不锈钢细管上加上了4.25kV (对比质谱仪毛细管入口处)的正向高压.质谱实验在Finnigan M AT LC Q离子阱质谱仪上进行.在质谱仪检测器的扫描设置中包含三个阶段:首先是质谱仪在400～2000mΠz的范围内作全扫描(Full scan)检测所有经过加热的毛细管进入质谱仪的离子;在对信号计数超过105(可另行设置)的丰度最大的离子在很小范围内进行精度很高的微扫描(Z oom scan)可用于确定离子的带电荷情况;最后质谱仪对已作微扫描的离子在离子阱中作MSΠMS,并将生成的所有碎片离子记录下来,质谱仪又回到全扫描状态并依次循环下去.所有这三个阶段均可在1s内完成3次,从而获得足够的质谱信息.CZEΠMS和CZEΠMSΠMS是一种灵敏度很高的高分辨率分析方法.若用极微量的微升电喷雾接口或纳升电喷雾接口,由于所消耗的样品非常少,检测限往往能达到fm ol(10-15m ol・L-1)低水平.若连用的质谱仪采用高灵敏度的FTICR-MS,检测限更能达到阿托摩尔(10-18m ol・L-1)水平[8].这对在蛋白质的研究中双向电泳凝胶上极微量蛋白质的鉴定提供了强有力的支持,且CIEΠMSΠMS还能产生高质量的CI D质谱图以提供对多肽结构进行解析所必须的信息,从而实现多肽的从头排序(de nov o sequencing).但同时也应看到CZEΠMS和CZEΠMSΠMS还存在着一些原理和技术上的限制性因素:如CZEΠMS中要求使用挥发性较好的缓冲溶液,但这些缓冲溶液的离子强度却较低,这势必会对CZE分离效度造成一定影响.CZE的检测限稍高,CZEΠMS 的接口处既要保证毛细管末端的分离电压,又要保证毛细管末端的喷雾电压,不但技术难度大,且易造成不稳定的因素.对这些问题目前已有一些解决办法:如在线的等速预浓缩[9]和固相微抽提[10],从而实现样品的在线浓缩.在CZE的分离缓冲溶液中加入一定比例有机溶剂,可增加其挥发性而提高电喷雾效率,还可提高CZE的分辨率.另外CZEΠMS接口研制也有长足进步.随着其不断完善与发展,它们在生物学各个领域中的应用势必拓宽与深化.2　MA LDI-T OF-MS法检测单核苷酸多肽及寡核苷酸的序列分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted Laser Des orptionΠionization time of flight mass spectrometry,M A LDI-T OF-MS)法是应用M A LDI对生物大分子进行离子化和质量分析,将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液并干燥,分子将嵌入质谱仪的真空小室,用瞬时纳秒(10-9s )强激光激发,使晶体中的分子解吸附转变成气相的离子态后再通过质谱分析这些离子.单核苷酸多肽(single nucleotide polym orphism ,S NP )是指DNA 序列中单个核苷单个核苷酸的变异引起的多肽,它占已知多肽的80%.存在与蛋白质编码区的S NP 可能与人类遗传疾病有关,对这些S NP 等位基因的检测有助于找到致病基因.应用M A LDI -T OF -MS 检测S NP [11]:1)测序分析DNA.M A LDI -T OF 质谱是新发展起来的一种高通量的DNA 测序技术.它可在几毫秒内完成一个样品的分析,且序列信息仅与DNA 分子的绝对质量有关.这就保证了测序结果的高度精确性.Fu 等[12]应用M A LDI -T OF -MS 对P 53抑癌基因的外显子5和8进行测序分析,发现了未知的S NP.但质谱法检测DNA 信号与分辨率随DNA 分子的增大而降低.其原因可能是较大的DNA 分子在M A LDI 过程中易片段化,较大的DNA 分子易与漂移管中的气相分子发生碰撞而分散,最终达不到检测器.目前已发展出两种克服大分子DNA 在M A LDI 过程中片断化的方法:(A )对质谱仪进行改进.使核酸的离子产生和加速之间存在一时间差,即延长离子提取(Delayed Iron Extraction ,DIE )可显著提高质谱的信号分辨率及减少核酸离子的片段化.(B )对化学试剂进行改进,提高核酸离子的稳定性.2)直接分析PCR 产物.为使M A LDI -T OF -MS 能直接分析PCR 产物,研究者采取以下措施:(A )分析等位基因特异的PCR 产物.设计质谱足以区分的等位基因的引物,可使质谱很容易分析PCR 产物.(B )用质谱检测纯化的酶连接产物.(C )检测来自PCR 产物的RE LP 产物.3)小型测序(minisequencing ).现已发展出将小型测序与M A LDI -T OF 质谱相结合的检测技术.据报道[13],应用小型测序与M A LDI -T OF 质谱技术成功地检测了RET 等基因的S NP.Haff 等[14]证明,该技术可同时分析PCR 产物中多个S NP.最近又应用小型测序完成对12个不同S NP 的多重基因分型[15].4)肽核酸(petide nuclei acid ,PNA )杂交探针,应用M A LDI -T OF 质谱技术分析PNA 杂交探针,筛查S NP.M A LDI -T OF -MS 是新发展起来的技术,它用于S NP 的检测是近年兴起并迅速发展着的一个研究领域.最近又发展出不需PCR 反应,应用M A LDI -T OF 质谱直接筛查S NP 的方法[16].总之,M A LDI -T OF -MS 对S NP 的高通量筛查及基因分型将会大大促进对遗传疾病,人类进化,药物及生物种群多样性等方面的研究.用M A LDI -T OF -MS 分析寡核苷酸样品最大的困难[17]就是基质的选择.目前国外已经报道的用于分析核苷酸的基质较多,其中应用较多的有:2,4,6-三羟基苯乙酮,2,5-二羟基苯甲酸等.这些基质在使用前须脱盐处理,且这些基质释放出的寡核苷酸的分子离子信号较难捕获,不同的碱基灵敏度差别很大.近来有报道[18],发现用混合基质2-氰基-4-羟基肉桂酸/3-羟基吡啶羧酸用于基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱中测定脱氧寡核苷酸,不仅能达到较好的分子离子峰,而且一些金属离子加合峰能得到有效的抑制,提高了测定的灵敏度.用3’-和5’-外切酶对脱氧寡核苷酸12-(5’ATG C AT AG C AT -3’)进行部分降解,再进行M A LDI -T OF -MS 分析,得到了完整的寡核苷酸序列.M A LDI -T OF -MS 的出现,为我们提供了寡核苷酸测序的新途径,它具有良好的灵敏度和112第3Π4期 文丽君,等:质谱技术的新进展及其在生命科学中的应用212海南师范学院学报(自然科学版) 2002年精确度.由于飞行时间质谱测定的分子量误差均在0.1%以内,对一些化学修饰的寡核苷酸单体的结构也可准确计算出来,且操作简便,样品用量少,可靠性强,有较好的应用前景.质谱在寡核苷酸或核苷酸中的应用前景是将色谱或电泳技术的强分离能力同质谱的高鉴别能力结合在一起,其中最有价值的是扩展液相色谱Π质谱联用技术.对多组分寡核苷酸无须分离,一次运行就可精确的测定每一组分的质量,从而确定每一寡核苷酸的特性[18].3　液相色谱-电喷雾质谱法分析糖蛋白糖生物分子的研究由于其糖链的复杂性给糖蛋白的结构分析带来了很大困难.但随着质谱新方法和新技术的发展,糖蛋白的研究近几年有了突破性的进展[19,20,21].采用液相色谱-电喷雾质谱结合蛋白酶解和糖苷酶解的方法为糖蛋白的分析提供了快速,灵敏的检测手段.通常对蛋白上糖链的结构分析需将糖链切割下来并回收,再进行色谱分析或质谱分析[22].通过将糖苷酶处理前后的糖蛋白酶解肽谱可确定糖肽的位置,糖结合位点,并通过串联质谱分析糖肽上所连糖链的结构.据报道[23],采用液相色谱-电喷雾质谱法(LC-ESI-MS)对糖蛋白-牛胰核糖核酸酶B的酶解肽谱进行分析,证实了其一级结构;通过比较糖苷酶处理酶解肽段前后的肽谱,确定了糖基化位点;并通过串联质谱(MSΠMS)解析了Asn连接的糖型结构,经а-甘露糖苷酶处理和质谱分析确定为高甘露糖型.参考文献:[1]　Fenn J B,et al.E lectrospray ionization for the masspectrometry of large m olecules[J].Science,1989,246:64-71.[2]　Beavis R C,Chait B T.Matrix-assisted laser des orption ionization masspectrometry of proteins[J].Methods Enzym ol,1996,270:519-551.[3]　Pleasanace S,Thibault P,K elly J.C omparis on of liquid-junction and coaxial interfaces for capillary electrophoresis-mass spectrometry with application to 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acids ,glycoprotein ,etc .K ey w ords :CZE ΠMS ΠMS ,MALDI -TOF -MS ;LC -ESI -MS ;biomolecular structual identification ;biomolecular sequence analysis 312第3Π4期 文丽君,等:质谱技术的新进展及其在生命科学中的应用。