基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立徐蓉;慎慧;黄媛媛;何丽华;倪丽君;郭建;吴文娟【摘要】目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)在常规临床微生物鉴定中的性能验证方法,指导临床实验室规范微生物鉴定程序.方法选取标准菌株、质控菌株和临床菌株共115株,包含革兰阳/阴性球菌30株、革兰阳/阴性杆菌31株、真菌30株,厌氧菌、苛养菌各12株,所有菌株均经Vitek Compact鉴定和/或细菌16S rDNA、真菌ITS DNA测序分析验证.任意选择3种MALDI-TOF MS微生物鉴定系统厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱,采用检测系统推荐方法进行菌株鉴定,进行准确度验证试验.精密度验证:选取标准菌株和临床菌株10株,1位操作者使用3个检测系统对10株菌株分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d;3位操作者使用3个检测系统对10株菌株每d分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d,从而验证鉴定结果的重复性.结果厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱对标准/质控菌株(除外厌氧菌)的鉴定符合率为100％;对临床菌株的属水平鉴定符合率为100％;对革兰阴/阳性杆菌的种水平鉴定符合率分别为100％、100％、96.77％;对革兰阳性球菌的种水平鉴定符合率分别为96.67％、96.67％、100％;对真菌的种水平鉴定符合率均为90％一致;对苛养菌的种水平鉴定符合率均为100％;对厌氧菌鉴定符合率为91.67％种水平一致.精密度验证试验结果重复性100％.结论 3种MALDI-TOF MS系统在革兰阳/阴性球菌、革兰阳/阴性杆菌、真菌、苛养菌鉴定的准确度和精密度符合要求,验证通过.本文建立的微生物鉴定质谱仪性能验证方案可满足综合性医院临床微生物实验室常规鉴定基本要求.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2018(036)010【总页数】5页(P783-787)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;性能验证;微生物鉴定【作者】徐蓉;慎慧;黄媛媛;何丽华;倪丽君;郭建;吴文娟【作者单位】上海市临床检验中心临床微生物室,上海200126;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123【正文语种】中文【中图分类】R446.520世纪90年代末，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)成功应用于微生物菌种鉴定并得到迅猛发展。
MALDI-TOF MS技术是根据细菌、真菌的特征性蛋白质指纹图谱进行微生物鉴定，通常只需要几分钟，大大缩短检测时间，可实现微生物的快速鉴定，提高感染性疾病的诊断效率[1-2]。
随着MALDI-TOF MS技术在国内外微生物鉴定领域的广泛应用，为了提高临床实验室微生物质谱鉴定操作规范性和结果一致性，2017年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)针对MALDI-TOF MS技术的应用颁布了CLSI M58 ED1-2017指南，对 MALDI-TOF MS系统性能验证(verification)提出具体要求。
我国相关领域专家编写了《中国临床微生物质谱应用专家共识》[3]，但未对微生物质谱检测系统性能验证方法进行规定，目前各临床实验室微生物质谱鉴定系统性能验证方案各异。
我们以CLSI M58 ED1-2017为基本依据，结合本地区实际情况探索临床常规使用的微生物鉴定质谱仪性能验证方法，旨在指导临床实验室实施统一规范的MALDI-TOF MS系统性能验证活动，从而提供客观准确的鉴定结果。
1 材料与方法1.1 菌株来源收集上海市及原卫生部临床检验中心室间质评菌株6株(柯氏柠檬酸杆菌xy201721、路邓葡萄球菌xy201722、艰难梭菌y201722、卵形拟杆菌y201723、普通拟杆菌y201724、脑膜炎奈瑟菌xy201723)、标准菌株16株(大肠埃希菌ATCC 25922、ATCC 35218，铜绿假单胞菌ATCC 27853，鼠伤寒沙门菌ATCC 14028，纹带棒状杆菌ATCC BAA-1293，金黄色葡萄球菌ATCC 29213、ATCC 25923，粪肠球菌ATCC 29212、肺炎链球菌ATCC 49619、败毒梭菌ATCC 12464、产黑色素普雷沃菌ATCC 25845、疮疱丙酸杆菌ATCC 11827、白念珠菌ATCC 90028、ATCC 90029，克柔念珠菌ATCC 6258、近平滑念珠菌 ATCC 22019)、临床常规分离菌株93株，其中，革兰阴性杆菌29株，革兰阳性杆菌2株，革兰阳性球菌30株，厌氧菌12株，苛养菌12株，真菌30株。
所有菌株均经Vitek Compact鉴定和/或细菌16S rDNA、真菌ITS DNA测序分析结果验证。
1.2 仪器与试剂 microTyper MS型质谱仪(厦门质谱公司)，MALDI TOF IVD MBT型质谱仪(布鲁克公司)，Autof ms 1000型质谱仪(安图生物公司)。
HCCA、三氟乙酸、标准溶剂(乙腈 50%、水47.5% 和三氟乙酸2.5%)、甲酸(Sigma-Aldrich公司)，血平板、巧克力平板、沙氏平板(赛默飞公司)，厌氧产气包(法国生物梅里埃公司)。
1.3 菌株复苏与传代所有入组细菌菌株接种至血平板或巧克力平板上，放入CO2培养箱35 ℃培养24 h，再挑取单克隆菌落转种培养24 h。
厌氧菌接种至血平板上，放入厌氧产气包35 ℃培养24 h。
真菌使用沙氏培养基35 ℃培养24 h。
所有菌株传代2次后鉴定。
1.4 质谱鉴定操作分别使用3套MALDI-TOF MS系统对菌株进行鉴定，依据制造商说明书的要求进行。
在1.5 mL离心管中加入300 μL无菌水，用接种环挑取5～10 mg新鲜菌体在水中充分混匀。
加入900 μL无水乙醇，混匀；12 000r/min离心2 min，弃上清，室温放置2 min使乙醇完全挥发。
加入80 μL 70%甲酸溶液，将沉淀吹打混匀，室温放置2 min，再加入80 μL乙腈，充分混匀后12 000 r/min离心2 min，上清溶液即为制备好的样品。
取1 μL样品点至靶点中心，晾干，再滴加1 μL基质溶液，晾干后打靶鉴定。
结果判定：使用布鲁克质谱和厦门质谱时，当MS评分≥2分，为鉴定到种结果可靠；当1.7分≤MS评分<2分时，为鉴定到属结果可靠；当MS评分<1.7分时，为没有可靠的鉴定结果。
使用安图质谱时，当MS评分≥9.5分，为鉴定到种结果可靠;当9.000分≤MS评分<9.499分时，为鉴定到属结果可靠;当MS评分<9.000分时，为没有可靠的鉴定结果。
1.5 检验程序性能验证方案1.5.1 准确度(1)常见病原体如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌每种类别至少验证30株，厌氧菌、苛养菌每种至少10株，并覆盖本地区、本实验室检出的重要病原体。
(2)验证试验用菌株经生化反应初步鉴定，细菌16S rDNA、真菌ITS DNA测序进行结果验证，确认菌株鉴定结果。
将所选已知菌株进行质谱鉴定，记录鉴定结果并比较与确认结果的一致性。
(3)可接受标准：依据CNAS GL41《临床微生物检验程序验证指南》[4]及《MALDI-TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识》[5]，按验证的标准/质控菌株、临床菌株分别计算鉴定符合率，标准/质控菌株符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90%以上。
1.5.2 精密度 1位操作者使用3个检测系统对10株菌株分别进行质谱鉴定，每天鉴定3次，连续鉴定3 d；3位操作者使用3个检测系统对10株菌株每d分别进行质谱鉴定3次，连续鉴定3 d，从而验证鉴定结果的重复性，进行精密度验证试验。
可接受标准：鉴定结果应一致，重复性100%。
2 结果2.1 准确度2.1.1 革兰阴性杆菌和革兰阳性杆菌共31株，包括大肠埃希菌5株、铜绿假单胞菌5株、肺炎克雷伯菌5株、产酸克雷伯菌1株、柯氏柠檬酸杆菌1株、弗劳地柠檬酸杆菌1株、鲍曼不动杆菌2株、豚鼠气单胞菌1株、黏质沙雷菌1株、阴沟肠杆菌2株、奇异变形菌2株、普通变形菌1株、嗜麦芽窄食单胞菌1株、鼠伤寒沙门菌1株、纹带棒状杆菌1株、蜡样芽胞杆菌1株。
与测序结果比较，厦门质谱和布鲁克质谱鉴定结果均为种水平一致，种水平符合率100%；安图质谱种水平符合率96.77%(30/31)，有1株蜡样芽胞杆菌鉴定结果为属水平一致。
见表1。
表1 3种质谱鉴定为属水平一致的结果菌株分类菌株名称株数厦门质谱评分布鲁克质谱评分安图质谱评分革兰阳性杆菌蜡样芽胞杆菌12.122.2699.035革兰阳性球菌鹑鸡肠球菌12.091.7489.707停乳链球菌11.972.0829.515厌氧菌卵形拟杆菌1 2.042.1079.382艰难梭菌12.041.7319.555产黑色素普雷沃菌(标准菌株)11.962.1069.569真菌克柔念珠菌12.051.8529.597新型隐球菌11.781.7869.506无名念珠菌11.971.7929.260无名念珠菌12.082.2729.141季也蒙念珠菌11.922.0079.3522.1.2 革兰阳性球菌共30株，包括金黄色葡萄球菌5株、人葡萄球菌2株、溶血葡萄球菌2株、表皮葡萄球菌3株、路邓葡萄球菌1株、头状葡萄球菌1株、粪肠球菌5株、屎肠球菌5株、鸟肠球菌1株、鹑鸡肠球菌1株、铅黄肠球菌1株、无乳链球菌2株、停乳链球菌1株。
安图质谱鉴定结果为100%种水平一致；厦门质谱鉴定结果为96.67%(29/30)种水平一致，有1株停乳链球菌在厦门质谱系统中的鉴定结果为属结果可靠；布鲁克质谱鉴定结果为96.67%(29/30)种水平一致，有1株鹑鸡肠球菌在布鲁克质谱系统中的鉴定结果为属结果可靠。
见表1。
2.1.3 厌氧菌共12株，包括多形拟杆菌3株、普通拟杆菌2株、卵形拟杆菌1株、艰难梭菌1株、产气荚膜梭菌1株、脆弱拟杆菌1株、败毒梭菌1株、产黑色素普雷沃菌1株、疮疱丙酸杆菌1株。
与测序结果比较，1株产黑色素普雷沃菌在厦门质谱系统中的鉴定结果为属水平可靠，1株艰难梭菌在布鲁克质谱系统中的鉴定结果为属水平可靠，1株卵形拟杆菌在安图质谱系统中的鉴定结果为属水平可靠。