– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
2
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品
Impact on Resolution
% Improvement
Double N
20 – 40%
Double k
15 – 20%
16
Double α
> 400%
影响分离度的因素
17
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发!
• 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查
• 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
7
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 精密度/进样重复性
• RSD ≤ 1%, n ≥ 5 • 分离度
– Rs ≥ 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
O-Si
O-Si OH O-Si O-Si OH
O-Si OH O-Si O-Si O-Si
OH O-Si O-Si
双重保留机理:
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
13
液相色谱的方法开发
14
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合
H+N(CH3)2
O-Si
O-Si
O-
离子交换作用
O-Si
O-Si
O- (CH) H+N OO-S- i 3 2
O-Si
O-Si
O-Si OO--Si
O-Si
当流动相为 pH68时, 硅醇基带负
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
IA
Fl
D
O
P
Fe
Fl I AO
Fl O
D
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N]
碱性及中性化合物
Fe
P
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
33
PD Fe
浓度2:80% 原料及制剂
浓度3:100% 原料及制剂
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药
浓度3 原料药
浓度4 原料药
浓度5 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
方法验证的复杂性
固定相
传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性 化合物峰形的影响
流动相 pH 7
Propranolol and Butylparaben Naphthalene
Acenaphthene
铝杂质含量 ~375 ppm Tf USP = 6.5
Amitriptyline
5
15
25
35
45
Minutes
24
固定相
• 改变流动相pH将使选择性发生极大改变
31
流动相pH值
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大
40
中性化合物的保留不受pH影响
35
30 酸性
中性化合物
Retention Factor (k)
25
20 酸性保留增强 [HA]
15
碱性保留增强 [B]
10
5 碱性
0
0
2
4
6
8
10
12
pH
Silica pH Range
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真
实变化
11
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max
实验参数 2 Min & Max
实验参数 3 Min & Max
实验参数 4 Min & Max
12
线性 Day 1-3
浓度1: 60% 原料及制剂
• 拖尾因子
– T≤2
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
8
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
9
方法验证- USP<1225>
验证的内容
类型1
6. Imipramine (B)
7. Amitriptyline (B)
8. Flavone (N)
9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB)
10. Diclofenac (W来自)11. Dioseb (A)
12. Octanophenone (N)
30
34
10 11
Hybrid Particle pH Range
32
Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18
pH 10, ACN
PD
Fe
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
α −1 k α k +1
Chemical
Maximized in UPLC Separations by:
Range of column chemistries Multiple particle substrates Wide usable pH range High retentivity Wide range in selectivity
– 再进行方法优化 • 梯度/温度
15
影响分离度的因素选择性最为重要
Rs = N
Physical
4
Maximized in UPLC Separations by:
Ultra-low dispersion system Small [< 2 µm] particles Higher pressure capability Well-designed columns
准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）
6
方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求
21
固定相
端基封口基团 合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
22
键合相(配体)：C18 残留硅羟基
硅胶基质
固定相
CSH C18
Fl
I A
D
O
P
Fe
CSH Phenyl-Hexyl I A
Fl
D
O
Fe
P
CSH Fluoro-Phenyl
IA
Fl DO
Fe
P
HSS C18 SB
Fl
I
OA
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18
pH 10, ACN
PD
Fe
Fl D
P Fe
Fl
O I AO
Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
阿密曲替林
6.00 7.00 8.00
26
固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿 润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的 保留时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔 内！
27
固定相
HPLC及HPLC/MS分析方法的开发 及其在药物分析中的应用
李晓东 中国食品药品检定研究院 北京 100050
E-mail: xdli@
HPLC及HPLC/MS法