Luna™ C8(2) & C5
• 减少疏水性化合物的保留时间 •减少分析的时间
Synergi™ Max-RP
• 疏水性和 C18柱类似 – 为一支C12柱 •提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合 物
Synergi™ Max-RP
Basic Drugs at Neutral pH
C18 phases
10.000
疏水性的比较
8.000
C8 phase
6.000
300Å C18 phase
4.000
k butylbenzene
2.000
0.000
Synergi Hydro-RP
Luna C18(2)
Synergi Luna C8(2) Luna C5 Luna Phe- Jupiter C18 Synergi
80
60
40
20
0
1
2
3
极性选择性
1+2
4
5
1+2
4
5
1 2
HO
min
O CH3 H HH
Estrone
min
HO
OH CH3 H HH
Estradiol
4
5
min
Synergi™
Synergi Max-RP - C12 Synergi Hydro-RP - C18 Synergi Fusion-RP – C18 Synergi Polar-RP – Phenyl
建立高效液相色谱分析方法的 一般步骤
• 通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高 效液相色谱分析方法必须解决以下问题：
• ①根据被分析样品的特性选择适用于样品分 析的一种高效液相色谱分析方法。
• ②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格 （柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔 径）。
• ③选择适当的或优化的分离操作条件，确定 流动相的组成、流速及洗脱方式。
Luna™ 5m C18(2) YMC-Pack™ 5m Pro C18 Synergi™ 4m Polar-RP® (Ether-linked Phenyl)
150x4.6mm
Mobile phase: 75:25 Methanol:water
Flow rate: 1 mL/min
Components: 1. Estrone 2. Estradiol
高效液相色谱分析技术— 方法开发
上海市食品药品检验所 陈桂良
方法开发
方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条 件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的 p见K光a或谱p性Kb质值、、氧溶化质还分原子行的为极、性浓和度大范小围、、紫溶外解可度 以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可 以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组 分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和 其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以 进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用 组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实 现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或 定量要求。
Max-RP
Hex
Polar-RP
Prodigy Phenyl
Jupiter C4
Luna Cyano
Luna Amino
极性选择性的考虑
首先考虑
• 固定相的极性封尾,封端基团
• 分析物的极性官能基之间的作用
极性选择性
如何增加极性的选择性
• 极性基团封端 • 极性基团镶嵌 • 苯基
极性选择性
Columns:
• ④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
分析物
• 理化性质 • 混合分析物的主要差异 • 分子结构和特性
● 方法开发前要确定的基本问题
1、分析物的物理、化学性质
样品基质----决定前处理方法 溶解性----决定正、反相方法 酸碱性----确定色谱柱类型、流动相组成 pKa----确定流动相的pH值 化学结构、特征官能团、Etc.
App ID 1125
Luna™ C18(2)
Ginseng Root
Column: Luna 5 µm C18 / ODS (2) Dimensions:150 x 4.6 mm ID Elution Type:Gradient Eluent A: Acetonitrile/water (15:85) Eluent B: Acetonitrile/water (80:20) Flow Rate:1.5 mL/min Temperature:25 °C Detection: UV-Vis Abs. – Variable Wave. @ 205 nm
HO
OH CH3 H
HH HO
Estradiol
O CH3 H HH
Estrone
mAU
175 Luna™ C18(2)
150
Байду номын сангаас
125
100
75
50
25
0
1
2
3
mAU
200 YMC-Pack™ Pro C18
175
150
125
100
75
50
25
0 mAU
1
2
3
100 Synergi™ Polar-RP®
•永远不会坏
•理想分离度
决定峰分离度的三个要素
• 峰保留时间 • 选择性(出峰的顺序) • 柱效
固定相的选择
• 疏水性的选择 • 极性的选择 • 苯基的选择
固定相疏水性考虑的要素
• 键合相的种类 (C18, C8, Phenyl, etc) • 表面积 • 键合相的键合率
色谱柱选择表
• 颗粒直径及形状(球型及不规则型) • 柱长及柱内径 • 表面积及孔径 • 碳负荷及键合类型
Silica Advantage
Balancing Efficiency & Backpressure
5µ 4µ 3µ
higher efficiencies
如何得到最理想的分析结果
流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰 保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好, 但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果 ,可以改变下列的一项或数项条件:
流动相 固定相 pH 温度
如何选择适当的色谱柱 理想的柱子
•可以适用于分析所有的化合物
● 方法开发前要确定的基本问题
2、混合分析物的主要差异
疏水性差异----用疏水性选择性强的色谱柱 极性差异----用具有极性选择性的色谱柱 芳香性差异----用芳香选择性色谱柱 混合差异----用多种选择型色谱柱 分子量差异----GPC、GFC
● 方法开发前要确定的基本问题
3、分子结构决定选用何种分析方法 HPLC-UV HPLC-IR HPLC-MS HPLC-ELSD Etc.