10.000
疏水性的比较
8.000
C8 phase
6.000
300Å C18 phase
4.000
k butylbenzene
2.000
0.000
Synergi Hydro-RP
Luna C18(2)
Synergi Luna C8(2) Luna C5 Luna Phe- Jupiter C18 Synergi
Columns:
Mobile phase: Flow rate: Components:
苯基的影响
Luna™ 5m C18(2) 150x4.6mm Luna™5m Phenyl-Hexyl 150x4.6mm Synergi™ 4m Polar-RP150x4.6mm
50:50 Acetonitrile:20mM Potassium phosphate pH 2.5
Luna™ C8(2) & C5
• 减少疏水性化合物的保留时间 •减少分析的时间
Synergi™ Max-RP
• 疏水性和 C18柱类似 – 为一支C12柱 •提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合 物
Synergi™ Max-RP
Basic Drugs at Neutral pH
C18 phases
• ④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
分析物
• 理化性质 • 混合分析物的主要差异 • 分子结构和特性
● 方法开发前要确定的基本问题
1、分析物的物理、化学性质
样品基质----决定前处理方法 溶解性----决定正、反相方法 酸碱性----确定色谱柱类型、流动相组成 pKa----确定流动相的pH值 化学结构、特征官能团、Etc.
Synergi™
Flow Rate (mL/min)
Synergi™ Max-RP
与C18柱性能类似的C12柱
Synergi™ Polar-RP®
• 保留极性和苯基化合物 • 100% 水溶液稳定 • 增加极性的选择性
Synergi™ Hydro-RP
• 疏水性非常强 • 极性封端100%水溶性稳定 • 增进极性的选择性
•永远不会坏
•理想分离度
决定峰分离度的三个要素
• 峰保留时间 • 选择性(出峰的顺序) • 柱效
固定相的选择
• 疏水性的选择 • 极性的选择 • 苯基的选择
固定相疏水性考虑的要素
• 键合相的种类 (C18, C8, Phenyl, etc) • 表面积 • 键合相的键合率
色谱柱选择表
• 颗粒直径及形状(球型及不规则型) • 柱长及柱内径 • 表面积及孔径 • 碳负荷及键合类型
Synergi Hydro-RP VS. Luna® C18(2)
Synergi™ Hydro-RP
Synergi Hydro-RP
Synergi Max-RP
Mobile Phase:
Gradient: Flow rate: Sample:
A: 20mM KH2PO4, pH 4.6 B: Acetonitrile A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 min 1.5 mL/min 1. Morphine 2. Hydromorphone 3. Codeine 4. Nalorphine 5. Oxycodone
Synergi™ Hydro-RP
Synergi™ Fusion-RP
• 增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间 • 在水溶液中100%稳定
mAU 500
VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\TEST0034.D)
400
300 极性增大
80
60
40
20
0
1
2
3
极性选择性
1+2
4
5
1+2
4
5
1 2
HO
min
O CH3 H HH
Estrone
min
HO
OH CH3 H HH
Estradiol
4
5
min
Synergi™
Synergi Max-RP - C12 Synergi Hydro-RP - C18 Synergi Fusion-RP – C18 Synergi Polar-RP – Phenyl
App ID 1125
Luna™ C18(2)
Ginseng Root
Column: Luna 5 µm C18 / ODS (2) Dimensions:150 x 4.6 mm ID Elution Type:Gradient Eluent A: Acetonitrile/water (15:85) Eluent B: Acetonitrile/water (80:20) Flow Rate:1.5 mL/min Temperature:25 °C Detection: UV-Vis Abs. – Variable Wave. @ 205 nm
● 方法开发前要确定的基本问题
2、混合分析物的主要差异
疏水性差异----用疏水性选择性强的色谱柱 极性差异----用具有极性选择性的色谱柱 芳香性差异----用芳香选择性色谱柱 混合差异----用多种选择型色谱柱 分子量差异----GPC、GFC
● 方法开发前要确定的基本问题
3、分子结构决定选用何种分析方法 HPLC-UV HPLC-IR HPLC-MS HPLC-ELSD Etc.
8
VW D1 A, W av elength=230 nm (F: \PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW 0503\ CARLO087.D)
m AU
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
VW D1 A, W av elength=230 nm (F: \PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW 0503\ CARLO088.D)
1.0 mL/min
Acidic, aromatic compounds 1. Indoprofen 2. Ethyl paraben 3. Naproxen 4. Diflunisal 5. Indomethacin 6. Ibuprofen
苯基的影响
mAU
140 120 100
80 60 40 20
200
100
0 0
mAU
2
4
6
VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\FUSI0046.D)
350
300
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
Running Conditions
Synergi Fusion-RP 4 80Å
疏水性减少
8
Luna™ 5m C18(2) YMC-Pack™ 5m Pro C18 Synergi™ 4m Polar-RP® (Ether-linked Phenyl)
150x4.6mm
Mobile phase: 75:25 Methanol:water
Flow rate: 1 mL/min
Components: 1. Estrone 2. Estradiol
10
12
一般的 C18柱
14
min
8
10
12
14
min
Mobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: Acetonitrile Flow rate: 1.5 ml/min Temperature: Ambient Detection: 210nm Injection: 1. Maleic acid
App ID 14436
Luna™ Phenyl-Hexyl
Green Tea(绿茶)
Column: Luna™ 5u Phenyl-Hexyl Dimensions: 250x 4.6mm Mobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Acetonitrile (91:9) B:Water/Acetonitrile (20:80) Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min t t=35min, hold 100%B for 10 min. Flow Rate: 1ml/min Temperature: 350C
如何得到最理想的分析结果
流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰 保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好, 但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果 ,可以改变下列的一项或数项条件:
流动相 固定相 温度
如何选择适当的色谱柱 理想的柱子
•可以适用于分析所有的化合物
Silica Advantage
Balancing Efficiency & Backpressure
5µ 4µ 3µ
higher efficiencies
lower backpressures
Plate Height (H) Pressure Drop (Bar)
Linear Velocity (mm/sec)
HO
OH CH3 H
HH HO
Estradiol
O CH3 H HH
Estrone
mAU
175 Luna™ C18(2)
150
125
100
75
50
25