收稿日期:2002211204基金项目:国家自然科学基金资助项目(20175034)作者简介:作者简介:刘晗青(1979～),女(汉族),江苏省常州市人,硕士研究生,分析化学专业3通讯作者:郭寅龙(1962～),男(回族),博士,研究员,分析化学专业,E 2m ail :ylguo @pub .si oc .ac .cn第24卷第2期2003年5月质谱学报Jou rnal of Ch inese M ass Spectrom etry SocietyV ol .24　N o .2M ay 2003傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质分析中的应用刘晗青,郭寅龙3(中国科学院上海有机化学研究所,上海　200032)[作者简介]:刘晗青,2001年毕业于中国药科大学,2001级中科院上海有机化学研究所分析化学专业硕士研究生。

主要进行生物质谱方向的研究。

在郭寅龙研究员的指导下,进行生物样品微量分析的高灵敏间歇电喷雾方法学研究,在《化学学报》等刊物上发表论文两篇。

摘要:对傅立叶变换2离子回旋共振质谱(FT I CRM S )的仪器特点及FT I CRM S 在研究蛋白质结构鉴定、蛋白质翻译后修饰和蛋白组学中的应用等方面进行了综述和讨论。

给出参考文献45篇。

关键词:质谱学;蛋白质分析;综述;傅立叶变换2离子回旋共振质谱(FT I CRM S )中图分类号:O 657163;Q 51217 文献标识码:A 文章编号:100422997(2003)0223632071　傅立叶变换-离子回旋共振质谱的仪器特点傅立叶变换2离子回旋共振质谱法(FT I CRM S )是离子回旋共振波谱法与现代计算机技术相结合的产物。

傅立叶变换2离子回旋共振质谱法是基于离子在均匀磁场中的回旋运动,离子的回旋频率、半径、速度和能量是离子质量和离子电荷及磁场强度的函数,当对离子施加与其回旋频率相同的射频场作用时,离子将同相位加速至一较大的半径回旋,从而产生可被接受的类似电流的信号。

傅立叶变换2离子回旋共振质谱法所采用的射频范围覆盖了欲测定的质量范围,所有离子同时被激发,所检测的信号经过傅立叶变换,转换为质谱图。

傅立叶变换2离子回旋共振质谱仪的优点十分突出[1],主要优点如下:(1)容易获得高分辨率。

FT I CRM S 的分辨率在一个较宽的质荷比范围内极高,远远超过其它类型的质谱仪[2]。

在一定的频率范围内,只要在足够长的时间内进行采样,均可获得高分辨数据,这样就能获得高的质量准确性[3～5]。

用FT I CRM S 可得到精度很高的精确质量数,这对于得到离子的元素组成是很重要的。

Schu rch 等[6]用N 2羧基苯邻二甲酰亚胺标记,鉴于FT I 2CRM S 的高分辨率,鉴定肽段时质量误差仅为0.003D 。

Kelleher 等[7]根据FT I CRM S 的高分辨率,设计不用色谱分离直接鉴定出CH 3 CD 32标记的肽的方法;(2)便于实现串极质谱分析。

可完成多级(时间上)串联质谱的操作,由于它可提供高分辨的数据,因而信息量更丰富。

多级串联质谱中采用碰撞诱导解离(Co llisi on 2induced dissociati on ,C I D )技术,将待分析的多肽离子在碰撞阱中分离,选中合适的离子碎成碎片,并记录片段的离子谱图。

理论上,任何一个多肽的C I D 谱包含了鉴定该蛋白质足够的信息[8,9](主要指低碰撞能的C I D)。

这种技术不仅可以用于纯蛋白的分析,而且可用于多种蛋白质的酶解混合物分析,理论上每个蛋白质如果至少能有一个多肽离子产生C I D谱,就能鉴定出该蛋白质。

因此,可能简化蛋白质水解前繁复的纯化步骤,并且可以直接分析蛋白质的混合样品,这就恰好满足了蛋白组计划分析大量蛋白质的需要。

但到目前为止,C I D谱图的解析仍是蛋白组工作的一个瓶颈。

(3)便于使用外电离源并与色谱仪器联用。

FT I CRM S一般采用外离子化源,便于与各种色谱仪器联用。

除此之外,灵敏度高[10]、质量范围宽、速度快、性能可靠等也是FT I CRM S的优点。

许多研究证明了质谱成功用于蛋白质四种结构的研究,即一级结构(氨基酸的线性序列)、二级结构(氨基酸折叠成定义好的形状)、三级结构(全部的三维折叠)及四级结构(多蛋白复合物中折叠多肽的空间安排)。

但是到目前为止,质谱在蛋白组学中的应用主要还是集中于一级结构的研究。

2　傅立叶变换2离子回旋共振质谱在蛋白质一级结构分析中的应用传统上,蛋白质的鉴定是从头测序,多数是自动的,逐步的化学降解(Edm an降解)蛋白质,然后分离多肽片段[11]。

这些局部顺序依靠重叠的片段拼装组合出整个蛋白质的顺序,但是更多的用于探针从基因库分离出编码该蛋白的基因。

随着序列数据库的增大,很明显,即使相对较短或不完善的序列(缺口,模糊的残基)对蛋白质的鉴定都是很有用的。

当意识到质谱能比较理想的产生期望的数据时,用从蛋白质或多肽提取的信息和序列数据库相关联的方法,而不是从头测序进行蛋白质鉴定的观念已经逐渐地深入人心[12]。

2.1　准确质量测定对蛋白质结构分析的应用价值氨基酸顺序测定的第一步就是蛋白质分子量的确定,这能为测定蛋白质分子中多肽链的数目和用质谱方法测定各个肽段的氨基酸顺序提供最基础的数据。

质量准确性的提高不仅能提高数据库搜索的速度,还能大大提高鉴定的可信度[13～15]。

用丰度为99%的13C标记物培养基培养细菌,使磷脂中的12C被13C所取代,一旦C原子数已知,有n个碳原子质量数就会增加n,比较分别用ES I FT I CRM S和(C I D)FT I CRM S 测得的天然和99%丰度的13C标记物培养基中磷脂的谱图,准确质量测定使其元素组成为唯一的可能[16]。

D em irev等[17]组合使用完整蛋白质的准确质量测定和蛋白组数据库,显著提高了鉴定微生物的特异性。

H e等[18]最近组合使用了高的磁场(9.4T),大的Penn ing阱的直径(101.6 mm)及低的离子浓度,用Λ2ES I FT I CRM S检测两种肽时质量分辨能力很高,这有可能成为蛋白组学研究的新突破点。

ES I FT I CRM S的准确质量测定还能可信的证实不确定的离子组成[19]。

2.2　蛋白质分子中氨基酸序列的测定蛋白质一级结构测定的一个最灵敏和最普遍的方式就是先用二维聚乙酰胺凝胶电泳分离蛋白质混合物,以胰蛋白酶消解,质量分析(分辨和分离一个特别的肽段)并最终用质谱方法产生一个至少是部分的氨基酸一级结构。

肽质量图谱(Pep tide m ass m app ing)是蛋白质一级结构测定一种最常用的手段。

肽质量图谱是基于序列特异性蛋白酶水解蛋白质衍生出来的肽的一个基团的准确质量的测定,是蛋白质鉴定的一个高效的方法。

不同氨基酸序列的蛋白质用序列特异性的蛋白酶水解后将会产生一系列该蛋白独特的质量指纹。

因此,如果用选择好的质量数(观察到的肽质量指纹)在一个包含有该特异蛋白的序列数据库中搜索,该蛋白就能依赖这个数据库正确的鉴定了。

采用纳流量液相色谱与傅立叶变换2离子回旋共振质谱联用,提供了一系列的胰蛋白酶消解后的母离子和子离子的质量,质量的准确性达到了10-6数量级,从而进一步确证了人肝的三种二乙酰基还原酶[20]。

另外采用n2ES I FT I CRM S在pm o l数量级的灵敏度上获得了蛋白质消解物的准确的质量指纹图谱,缩小了数据库的搜索范围并降低了搜索的噪声,测得了该种乙醛氧化酶的序列[21]。

应用ES I FT I CRM S和红外多光子解离(I R m u lti p ho ton dissociati on, I RM PD)可对一种糖激酶进行分子量和肽的一级结构的精确测定[22]。

2.3　蛋白质分子中二硫键位置的确定蛋白质分子中常有二硫键作为共价键交联463质谱学报 第24卷　一条多肽链链内或多条多肽链链间的两个半胱氨酸,确定二硫键的位置对于鉴定蛋白质一级结构有着重要意义。

近来Ge Y ing等[23]用电子捕获解离(E lectron cap tu re dissociati on,ECD)技术成功地对大肠杆菌的细胞抽提物中催化维生素B1生物合成的几种酶进行了二硫键等全面的结构鉴定。

2.4　在分析蛋白质表达上的应用获得蛋白质表达程度方面的信息是很有价值的,因为这是一个给定细胞的特征状态,直接反映了该细胞的生理功能,并且和信使核糖核酸(M essager ribonucleic acid,m RNA)表达的程度不直接相关。

常用的方法是用稳定性同位素标记(如2H,13C,15N等)。

样品中所有的肽以相同的序列对出现,但是质量不同。

因为这些肽对有相同的物化性质,它们在分离和离子化时就能表现相同的性质。

因此,低质量和高质量成分的信号强度的比就能提供一个可信的准确的这两种肽的相对比例。

Sm ith等[24]用贫化天然丰度极低的同位素(如贫化13C,15N,2H)标记的培养基和普通培养基培养细胞,为所有待检测的蛋白质提供了“内标”。

将用普通的细胞与标记的细胞在样品处理过程前混合,这样就排除了细胞裂解、分离和质谱分析引入的实验误差。

最后,用FT I CRM S 检测并比较了200种不同的蛋白质。

后来发展了更高效方便的定量方法——同位素编码亲和标记法(Iso top e2coded affin ity tags,I CA T)[25]。

这种方法是用重的同位素试剂(d8)和一般试剂(d0)对半胱氨酸选择性烷基化。

混合两种蛋白质的混合物,用胰蛋白酶水解,通过一个单体抗生物素蛋白的琼脂糖柱子,富集有生物素标记的蛋白质。

用微毛细管液相色谱2电喷雾电离串级质谱(L C2ES I2M S M S)选择性分离,I CA T2标记的肽对的离子信号强度就可以精确的提供两种蛋白的定量信息,随后的M S M S可以用来鉴定该种蛋白质。

I CA T试剂的使用同时实现了蛋白质的定性和相对定量[26]。

3　傅立叶变换2离子回旋共振质谱在研究蛋白质翻译后修饰中的应用生物活性的肽要表达它们的生物活力,就要在细胞中通过一系列的生物过程来合成,这一系列的过程起始于转录,然后翻译成前体蛋白。

新生的前体蛋白再通过内质网,高尔基复合体等转运时发生蛋白水解和翻译后修饰生成有活力的肽。

重要的翻译后修饰包括蛋白质水解、酰基化、羧基化、糖基化、脂化、胺化、磷酸化和硫酸化。

蛋白质经过这样的修饰,在结合、催化、调节以及物理性质等方面都被赋予了新的功能。

3.1　蛋白质分子中磷酸化肽的序列的分析仅次于蛋白质水解,蛋白质磷酸化是最重要和独特的一种翻译后修饰。

能进行磷酸化的氨基酸有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

蛋白质磷酸化和去磷酸化的重要性在于在细胞信号传递过程中的作用及对许多蛋白质、激素、神经递质和肽等保持生物功能的关键性作用。