浅谈蛋白质质谱分析方法及应用董义龙(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景着出展望。

关键词：蛋白质质谱分析原理与方法蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。

作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。

关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。

随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

1 蛋白质组学研究的背景和意义1．1蛋白质组学的产生20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。

经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。

在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。

这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。

要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。

对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。

后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。

它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。

但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。

因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。

1．2蛋白质组学的概念“蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。

』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。

蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。

它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。

实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。

蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。

这一术语一经提出，很快得到国际生物学界的广泛关注。

第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第一部蛋白质组学专著。

2000年三月首次发表了一个生物体的完整蛋白质组。

2001年二月和同年六月分别公布了人类基因组框架图和序列图谱，极大地促进了蛋白质组学的兴起，成为后基因组计划的重要组成部分。

1．3蛋白质组学研究的主要手段蛋白质组研究包括对蛋白质的表达模式的研究和对蛋白质功能模式研究的两个方面。

它核心实验工具是双向凝胶电泳和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。

蛋白质组分析首先要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质，目前一般采用1975年由‘Farrell 等创立的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术pJ。

双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化通过分析软件(如PDQUEST)可对数字化的图谱进行各种图像分析，包括分析蛋白质在图谱上的定位，分离蛋白质的计数，图谱间蛋白质差异表达的检测等。

对分离出的蛋白质进行鉴定是蛋白质表达模式的又一重要内容。

为适应大规模蛋白质组分析，质谱已成为蛋白质鉴定的核心技术。

除此之外，还有Edman降解法测N端序列，氨基酸组成分析等。

由这些技术测得的完整蛋白质分子量、蛋白质的肽指纹图谱以及部分肽序列等数据，通过相应的数据库的搜寻来鉴定蛋白质。

生物信息学是蛋白质组学中的一个重要的技术平台，它研究生物信息的采集、加工、分析、存储和传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、工程科学以及生物学的技术、方法分析大量而复杂的生物学数据来揭示生物学的奥秘，是蛋白质组学中的不可或缺的一部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：…是构建和分析双向凝胶电泳图谱，二是数据库的搜索与构建。

2质谱原理、发展及生物质谱技术2．1质谱及质谱分析的基本原理质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。

目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。

[1,2]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。

传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。

目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。

1）质谱分析蛋白的原理：质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。

通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。

2）基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）简而言之，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/ 电荷之比（M/Z）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。

基质辅助激光解吸附质谱技术（MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。

MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。

MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。

3）电喷雾电离质谱（ESI-MS）电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。

电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。

电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液-质联用（LC-MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。

4）快原子轰击质谱技术快原子轰击质谱技术（FABMS）是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。

FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。

而FABMSMS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息。

3质谱分析蛋白的方法用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：肽质量指纹图谱法（PMF）、串联质谱法（CID）和梯形肽片段测序法（ladderpeptide sequencing）。

3.1肽质量指纹图谱（PMF）肽质量指纹图谱（PMF）即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。

由此可见，分子质量的精确度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符，故这就需要与序列信息适当结合。

3.2串联质谱法（CID）串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。

串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。

3.3梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing）梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing），与Edman法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。

其中的问题是由于酶解速度不一，易受干扰。

4 蛋白质质谱分析法的研究进展自约翰·芬恩和田中耕一发明了确认生物大分子结构的分析方法及其质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。

它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施，已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一。

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：灵敏度高，能为亚微克级试样提供信息；能最有效地与色谱联用；适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定；同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

4.1 质谱分析方法与蛋白质分析的联系蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，其复杂结构主要包括一级、二级、三级或四级结构。