・综述・p 53与胰腺癌及其基因治疗的研究进展鲍英　袁耀宗 p 53基因是人类肿瘤细胞中突变频率最高的基因。

大量研究表明,p53功能失活的肿瘤细胞更具有侵袭性,并对放、化疗更不敏感。

胰腺癌中普遍存在p 53基因异常[1],p 53对胰腺癌的发生、发展及其对放、化疗敏感性的作用引起消化界的广泛关注。

近年来,恢复肿瘤细胞的野生型p 53基因表达已成为一种有效的基因治疗途径。

本文对p53基因与胰腺癌的关系以及胰腺癌p53基因治疗的研究近况综述如下。

一、p 53基因及其产物的结构和功能1.p53基因及产物的结构:人类的p53基因位于17号染色体短臂17p 13.1,长20kb ,由11个外显子和10个内含子组成。

p53基因在进化中很保守,有5个高度保守区,它们可能对p 53的功能起着很关键的作用。

p53基因的转录产物为2.5kb mRN A ,编码393个氨基酸的核蛋白。

p53蛋白的半衰期极短,相对分子质量约53×103,具有与单链或双链DN A 结合的能力。

它包括4个主要功能区:N 端是转录活性区(1～42AA ),可与腺病毒的E1B-55kDa 蛋白和人类的M DM 2蛋白结合,阻止p 53的转激活活性;中间是序列特异性DN A 结合区(102～292A A ),突变常发生在这个区域;C 端包括一个寡聚区(323～356A A )和一个调控区(360～383A A )。

正常细胞中p53蛋白含量很低,但在人类肿瘤及培养的转化细胞中可高达正常的5～100倍。

2.p53基因及产物的功能:正常p53基因,即野生型p53,是一种抑癌基因,其功能类似“分子警察”,监视并维持细胞基因组的完整性。

D NA 受到损伤后,野生型p 53被激活,诱导细胞在G 1期停滞,复制停止,以便有足够的时间修复损伤的DN A 。

如修复失败,野生型p 53就活化那些诱导凋亡的基因的转录,如上调靶基因Bax 和p21(w af-1),同时抑制Bcl-2基因,使细胞凋亡,从而阻止具有癌变倾向的基因突变细胞产生[2]。

p53基因最常见的突变为错意突变,然后第二个等位基因会丢失,突变的基因就变成了纯合体。

p 53功能失活存在于近半数以上的肿瘤细胞中,可见该基因在肿瘤的发病中占有重要地位。

突变后的p53基因,即突变型p53,是一种癌基因,不仅引起p53抑癌活性的丧失,而且可以使编码产物的调节紊乱,细胞分化障碍,生长失控乃至癌变[3]。

其蛋白产物的构型发生变化,半衰期延长,稳定性升高,易在细胞核内堆积。

通过免疫组化法可检测到它的过量表达,而野生型p53蛋白则不能被检测到。

因此,p 53蛋白免疫组化阳性,则提示肿瘤细胞有p53基因的突变。

二、p 53基因与胰腺癌的关系1.p53基因在胰腺癌中的表达:p53基因的失活通常被作者单位:200025　上海,第二医科大学附属瑞金医院消化科通信作者:鲍英,E-mail:baoyin g2004@认为是胰腺癌发生中的晚期事件[4,5]。

p 53基因在胰腺癌中的突变率为60%～80%[6],阳性率报道不一可能与所选择样本量的大小和检测方法有关,至今尚未发现与性别、年龄的关系。

M oor e 等[7]用直接序列分析和特异性甲基化聚合酶链反应对22株胰腺癌细胞系的基因改变进行研究,发现这些细胞系中的p53变异高达95%。

G erdes 等[8]也通过PCR -SSCP 、直接测序和免疫组化的方法分析了7例胰腺癌患者p53基因的变异情况。

研究中的5例有p53变异。

W ada [9]还发现胰腺癌的p53突变常伴有杂合子丢失(LO H)。

这种高突变率说明p53基因在胰腺癌的发生发展中起着重要的作用。

Do ng 等[6]对p53基因在胰腺癌中的突变情况做了进一步研究。

他们对72名胰腺癌患者的p 53核心外显子4-9(密码子33-331)进行直接DN A 序列分析,发现62.5%(45/72)的患者中有p 53突变,包括38例点突变和7例移码突变。

点突变包括68.9%(31/45)转换和15.6%(7/45)易位。

39.5%(15/38)的点突变为第8外显子密码子273处的CGT (精氨酸)变为CA T (组氨酸)。

34.2%(13/38)的点突变为第7外显子密码子248处的CG G (精氨酸)变为T G G (色氨酸)。

在7例移码突变中,4例发生在外显子4,2例发生在外显子5,1例在外显子6。

2.p 53与胰腺癌的分期、诊断和预后:p 53与胰腺癌分期之间的关系尚有争议。

N ag y 等[10]采用非放射性同位素印记法检测胰腺癌患者的p 53拷贝数,结果经log istic 回归分析显示,肿瘤分级与p53基因的缺失呈正相关。

但D ong 等[6]的最新研究却显示p 53异常与胰腺癌分化的程度无关。

因此,两者之间的关系尚待进一步研究证实。

p 53基因变异对胰腺癌的诊断和预后有重要的意义。

L u 等[11]检测到胰腺癌患者胰液和粪便中p 53基因的突变率分别为47.4%(18/38)和37.1%(23/62),而胰腺良性疾病的突变率仅为12.5%(2/16)和19.1%(4/21),提示对胰液和粪便的p53基因检测可能是及早准确诊断胰腺癌颇有前景的方法之一。

G azzanig a 等[12]通过检测切除组织标本的野生型或突变型p53的表达并观察p53阴性和阳性患者的生存期,来研究p 53突变对胰头癌患者胰头十二指肠切除术后生存期的作用。

结果显示,野生型p53的表达和患者生存期的延长显著相关,尤其对于没有淋巴结转移的患者。

因此他们认为术前p 53检测有利于决定哪些患者需要行扩大手术。

虽然也有学者认为p53与预后的关系不明显[13],但是表达野生型p 53患者的治疗效果的确相对较好[14]。

尽管如此,毕竟p53基因并不是评估胰腺癌患者预后的独立因素[6]。

3.p 53与胰腺癌对放、化疗的敏感性:许多实验表明,化疗和放疗后,表达野生型p53的肿瘤可有大量细胞凋亡,产生明显的生长抑制。

而p 53表达缺陷的肿瘤在治疗后却往往仍然继续生长扩大,仅很少的细胞发生凋亡。

p53突变显然—126— 胰腺病学2004年6月第4卷第2期　Chin J Pan creatol ,June 2004,Vol .4,No .2与肿瘤的放、化疗耐受有关。

M ohiuddin等[15]评估了野生或突变型p53对5-F U和放射线协同治疗胰腺癌效果的影响。

研究中的3种胰腺癌细胞系为:含野生型p53的细胞系(Capan-2)和两株含突变p53的细胞系(Panc-1和M IA PaCa-2)。

对3株细胞分别进行克隆基因测定以检测5-FU,放射线,及放射线与5-FU合用对细胞生长和克隆形成能力的影响。

结果发现,放射线提高了Capan-2细胞中p53和p21 (waf1/cip1)的表达。

而在Panc-1细胞中无提高。

M I A P aCa-2细胞中p21(wa f1/cip1)下调,p53蛋白无增加。

克隆基因测定表明,放射线上调了表达野生型p53的Capan-2细胞中胸核苷酸合酶(T S)mR N A的表达,而没有上调p53突变型细胞系中的T S mR NA水平。

说明p53状态很大程度上影响放射敏感性,且有野生型p53表达的细胞比突变型细胞对放射线更加敏感。

放射线和5-FU联合应用时,在野生型p53表达的细胞中为叠加效应,而在突变型细胞中为协同效应。

三、胰腺癌的p53基因治疗基因治疗是以基因作为靶点的治疗,通过修复有缺陷的基因功能达到治疗疾病的目的。

胰腺癌预后极差,目前放、化疗的效果不佳。

修复肿瘤抑制基因被认为是提高胰腺癌治疗效果的很有希望的方法。

由于人类胰腺癌中普遍存在p53基因变异,因此p53成为胰腺癌基因治疗的首选,并已取得了令人满意的效果。

1.逆转肿瘤的恶性特征,抑制肿瘤生长:利用肿瘤细胞和正常细胞中p53有无突变的差别,可通过把野生型p53基因转入胰腺癌细胞,用其表达的野生型p53蛋白使肿瘤细胞发生凋亡,从而抑制肿瘤细胞的生长,达到治疗目的。

Ghaneh 等[16]将重组腺病毒介导的野生型p53(A dp53)转入5种胰腺癌细胞中,同时在小鼠皮下接种肿瘤,观察肿瘤细胞和移植瘤的生长情况。

所有胰腺癌细胞系均出现了明显的生长抑制,A dp53转染引起肿瘤细胞大量凋亡。

动物实验表明,注射A dp53后,小鼠皮下移植瘤的生长明显受到抑制。

这说明复制缺陷腺病毒载体是转染野生型p53基因的有效工具,p53基因治疗是通过诱导凋亡而抑制胰腺癌细胞生长的。

除腺病毒载体外,转染野生型p53也可使用非病毒基因转移载体。

聚氮丙啶(P EI)衍生物的细胞毒性很小,是其中极具潜力的一种。

M er lin等[17]以转葡糖基酶PEI为载体将p53基因转入p53缺失的胰腺癌PA N C3细胞后,p53蛋白很快恢复了表达,之后被转染的细胞进入凋亡。

p53基因转染也可与一些前体药物活化酶联合使用。

M er cade等[18]以细胞色素p450-2B1原位激活环磷酰胺后将腺病毒介导的野生型p53导入胰腺癌NP-18细胞系,分析细胞活性和细胞周期。

在小鼠皮下接种肿瘤,观察肿瘤的生长情况并进行组织学分析和细胞周期分析。

结果显示N P-18细胞系的细胞活性显著降低,G1期前的细胞明显增多。

动物实验显示,用细胞色素p450-2B1原位激活环磷酰胺后肿瘤体积快速缩小,导入p53后肿瘤持续减小。

说明细胞色素p450-2B1原位激活环磷酰胺后导入p53可以识别DN A损伤,加速肿瘤的退化,可能成为治疗人类实体瘤的有效方法。

2.增强放、化疗敏感性:目前,放、化疗均不能显著改善胰腺癌的预后。

突变的p53基因或失活的p53蛋白阻碍了DN A的修复或凋亡的诱导。

这可能是一些肿瘤对放、化疗抵抗的重要原因之一。

p53基因置换新疗法的出现令人振奋,因为p53可修复损伤的D NA,从而提高胰腺癌对放、化疗的敏感性。

Cascallo等[19]将Adp53导入胰腺癌细胞并用两种基因毒性药物,吉西他滨和顺铂处理,然后进行活细胞测定。

结果表明,药物处理前转导野生型p53会产生耐药性,但药物处理后转导p53可增加药物的细胞毒性作用。

细胞周期检测显示外源性p53的表达引起细胞周期阻滞,S期的细胞百分比显著降低,使对药物敏感的细胞数减少。

顺铂并非特异性地杀伤S期细胞,因此在p53基因导入后,细胞对顺铂的敏感性没有太大改变。

而药物处理后再导入野生型p53的效果较好,因为后导入的p53可识别此前药物导致的DN A损伤,并使G1期之前的细胞数增多。

这与annex in检测结果和bax/bcl-2的比值相一致。

同时,移植瘤实验证实了该方法在体内的有效性。

因此,联合应用p53转导和化学治疗时,要注意给药的顺序,才会得到满意的治疗效果。