基因治疗研究进展虎　艳　(甘肃省张掖医学高等专科学校　734000)摘　要　基因治疗是21世纪具有很大发展前景的新医疗技术,有望成为人类战胜疾病的利器。

本文阐述了基因治疗技术的发展和应用进展。

关键词　基因治疗　载体　癌基因 基因治疗(genetherapy)是医学领域中发展起来的一项新技术,它主要是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段,来纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常基因的表达,从而达到治疗疾病的目的。

基因治疗通常包括基因替代、基因修饰、基因修正、基因抑制或失活等。

上世纪80年代初,Anders on首先阐述了基因治疗的概念。

1990年美国的B lease等成功地进行了世界上首例临床基因治疗,即对腺苷脱氨酶(adenosinedeam inase,ADA)缺陷病人进行了基因治疗。

1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得成功[2]。

目前,基因治疗已从遗传病扩展到心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病及传染病等。

此外,基因治疗也能用于亚健康状态的治疗,如疲劳、肥胖、脱发、衰老等。

然而基因治疗依然存在诸如缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和寄主产生免疫反应等一系列问题。

但随着科学家对人类基因及其功能、疾病发病的分子机制研究的不断深入,不久的将来基因治疗一定会给人类健康事业带来深远的影响。

1　基因治疗的方法基因治疗有两种途径:①把一个健康的正常基因拷贝插入病变靶细胞以补偿缺陷基因;②引入经过改造的基因来赋予细胞新的特性。

目前基因治疗常用的技术有体内疗法(in vivo)和体外疗法(ex vivo)两种。

1.1　体内疗法　体内疗法是将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸DNA直接导入受体体内有关的器官组织和细胞内,以达到治疗目的。

这是一种操作简便易行的方法,如静脉注射、肌肉注射、器官内灌输、皮下包埋等,但其缺点是基因转染率较低,疗效短。

例如在遗传性疾病的基因治疗方面,以腺病毒等为载体的体内疗法常见于囊性纤维变性(cystic fibr osis,CF)的基因治疗研究。

CF为一种白种人常见的致死性疾病,是累及少数器官系统的常染色体隐性遗传病,该病是由于跨膜转导因子(cystic fibrosis trans membrane conductance regulat or,CFTR)基因发生突变导致上皮细胞氯离子通道异常,从而使肺、胃肠道、胰腺和肝胆系统等多种器官功能受损。

在CF累及的器官中目前只有肺可作为基因治疗的靶器官,载体主要是腺病毒,还有脂质体、质粒和与腺相关病毒载体。

1.2　体外疗法　目前研究和应用较多的还是体外疗法,即将有基因缺陷的细胞取出,在体外将外源基因导入到载体细胞,然后将基因转染后的细胞回输给受者,使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物,以达到治疗目的。

例如,1991年复旦大学遗传学研究所与第二军医大学长海医院血液科合作进行的血友病B 基因治疗就是利用皮肤成纤维细胞为靶细胞的体外疗法。

该方案应用XL C I X和N2C MV I XC9逆转录病毒载体转染患者的成纤维细胞,以细胞胶原悬液注射到患者皮下,使患者血浆中F I X抗原和F I X活性升高1～2倍,并持续两年以上,患者鼻出血等症状有所好转,每年所需输血次数也减少。

此后又进行了2例血友病的基因治疗,跟踪4～7年未发现与基因治疗相关的毒副作用,但转入的F I X表达水平仍有待进一步提高[2]。

另外,W ils on等应用肝细胞为靶细胞的体外疗法治疗了家庭性高胆固醇血症(fam ilial hyperchlester olae2 m ia,FH)。

FH是一种由于低密度脂蛋白受体(l ow density lipop r otein recep t or,LDLR)功能或表达异常所致的遗传病。

W ils on等首先切除患者部分肝以获取原代培养的肝细胞,然后在体外用含LDLR cDNA的逆转录病毒载体转染后回输,经门静脉注射植入肝脏。

治疗后患者血液中LDL水平较治疗前下降约30%,LDL/ HDL(低密度脂蛋白/高密度脂蛋白)之比从治疗前10～13降至5～8,这一水平维持了18个月以上。

由于该方案需要切除患者约1/3的肝脏,目前已停止临床应用[2]。

2基因治疗的载体基因治疗载体可分病毒性载体和非病毒性载体两大类。

2.1　病毒性载体　包括逆转录病毒(R t)、腺病毒(Ad)、疱疹病毒(HS V)及腺相关病毒(AAV)等。

2.1.1　逆转录病毒载体　逆转录病毒(R t)是一类可在感染细胞内将其RNA反转录为DNA的病毒。

R t最大的优点是可以有效地整合到靶细胞的基因组中,并稳定持久地表达所带的外源基因,病毒基因组以转座的方式整合,其基因组不会发生重排。

因此所携带的外源基因也不会改变,而且转染率高。

2.1.2　腺病毒载体　腺病毒(Ad)是一种线性双链DNA病毒,基因组长约30～50kb,由非结构性早期基因、编码结构蛋白的晚期基因和RNA聚合酶转录子组成。

与逆转录病毒家族载体不同,腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组中,而是以附加体的形式存在,不随宿主细胞分裂而复制,是典型的过性表达载体[4]。

这一特性对用于短期基因治疗是很有前途的,如肿瘤治疗。

因肿瘤基因治疗的目的基因往往是产生激活杀伤细胞的酶或免疫调节蛋白,不需长期表达,而Ad载体本身引起的免疫反应也有利于杀伤肿瘤细胞。

2.1.3　疱疹病毒载体　疱疹病毒(HS V)的基因组都是大型线性DNA,长约150kb,包含70～80个基因。

它的优点在于具有一定的嗜神经性,被用作中枢神经系统靶向的良好载体。

除对神经细胞有亲和性之外, HS V还能感染多种细胞,包括肿瘤、肌肉、肝、肺和胰岛细胞。

HS V载体的另一优点是载体容量很大,可容纳高达50kb的外源DNA,因此可同时装载多个目的基因。

目前,这种载体在神经系统的基因治疗方面得到了广泛的应用。

2.1.4　腺相关病毒载体　腺相关病毒(AAV)的基因组主要包括rep cap两个基因,能将外源基因定点整合到宿主细胞上,因而具有一般病毒载体所不具有的特性。

AAV载体是目前安全性最高的载体,其优点是生物安全性高、宿主范围广泛、可以介导长期的基因表达,被认为是最有希望的病毒载体之一。

将带有LacZ 基因的AAV载体注射入肌肉后,在肌纤维中β-gal阳性可持续2年。

这说明AAV特别适合在活体条件下将基因转入特定的靶细胞,同时又不诱发机体对被感染细胞产生免疫反应[2]。

2.2　非病毒性载体　包括脂质体、分子偶联载体、裸露DNA等。

由于病毒性载体存在靶向性和组织特异性差、可控性小等安全性问题,目前非病毒性载体的研究越来越受到人们的重视。

脂质体、裸露DNA等非病毒性载体都能进行自我复制,无免疫原性,但其介导的基因转移缺乏靶向性和组织特异性,体内导入效率低且易被网状内皮系统所吞噬。

而近年来发展起来的应用分子偶联载体包括一些能与核酸结合的蛋白或其配体介导的基因转移,它克服了以上载体的缺点,受到广泛关注[2]。

2.2.1　脂质体　由脂双分子层组成的颗粒,可介导基因穿过细胞膜。

通过脂质体介导比利用病毒转导进行基因转移具有以下明显的优势:①脂质体比较容易与基因复合;②易于大量生产;③将目的基因导入细胞后,脂质体易被降解,且无毒、无免疫原性;④DNA或RNA可得到保护,不被灭活或降解;⑤所携带的基因可能转运到特定部位;⑥转染过程方便易行,重现性好。

迄今为止,许多实验室开展了有关脂质体载体的研究工作,实验结果显示,采用脂质体进行体内基因转移,肺是目的基因表达水平最高的靶器官。

2.2.2　裸露DNA　Tri pathy等将小鼠红细胞生成素(EPO)cDNA与含巨细胞病毒(C MV)启动子的表达质粒连接,鉴定后直接给成年小鼠注射,可使小鼠血红细胞明显升高,并且至少持续表达90d,说明所构建的表达载体在小鼠肌肉细胞内能成功表达活性EPO。

其优点为免疫反应小,副作用低。

但其缺点是需要较大剂量的DNA,一般大于50μg才能见效,而且只能维持2～3个月[2]。

2.2.3　分子偶联载体　是将外源DNA通过一定方式共价结合到细胞表面特异受体的配基或单克隆抗体等,利用特异结合特性介导外源基因进入到其他类型的细胞中。

在正常情况下,分子偶联载体通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞后,形成胞内体。

胞内体膜破裂后,外源DNA进入细胞质,再进入细胞核内进行基因表达。

但胞内体往往容易与溶酶体结合,导致DNA被其中的核酸酶降解或破坏,降低了基因转移效率。

当Ad通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞后,可以促进胞内体膜的破裂,降低溶酶体对DNA的降解作用,大大提高了基因转移效率。

所以人们把Ad与分子偶联载体偶联,所形成的Ad-多聚赖氨酸DNA复合物进入细胞,可有效地避开溶酶体降解途径[2]。

3　基因治疗的应用基因治疗已经在肿瘤性疾病及神经性疾病等人类疾病的治疗中作了不少尝试。

3.1　肿瘤性疾病基因治疗　因肿瘤患者对基因治疗这种新型治疗方法的临床迫切性较强,且患者和家属们容易接受,伦理学问题也较少,所以肿瘤性疾病基因治疗的研究最受瞩目,目前大多数基因治疗临床研究都是对肿瘤性疾病的基因治疗。

3.1.1　利用反义RNA的基因治疗　由于细胞癌基因的激活或过度表达,导致许多癌症的发生。

因此可以利用影响癌基因的转录翻译等过程来达到扰乱癌基因的功能。

反义RNA是一类合成的短链核苷酸序列,它们能相对容易地进入肿瘤细胞,并与癌基因的特定mRNA序列结合,使癌基因的转录和翻译等过程被选择性地抑制或干扰,从而达到抑制肿瘤基因表达的目的。

如用反义K-ras封闭胰腺癌、肺癌的K-ras癌基因,使其丧失产生癌基因蛋白质的能力,对癌细胞具有明显的抑制作用。

3.1.2　基因免疫治疗及肿瘤疫苗的应用　这是目前在癌症的基因治疗中应用最为广泛的一种方法,通过向患者体内引进能增强患者免疫功能的基因,增强患者自身的免疫系统以达到治愈癌症的目的。

Rosenberg 率先开展了肿瘤免疫基因治疗的临床试验。

将产生白介素-1(I L-1)、白介素-2(I L-2)及肿瘤坏死因子等相关的基因导入到体外培养的肿瘤浸润细胞中,其杀伤肿瘤的功能就会明显提高,肿瘤周围的抗肿瘤免疫反应得到增强,从而使肿瘤的生长抑制。

由于诱导肿瘤细胞对某些细胞因子的表达可增强其抗原性,使淋巴T细胞更容易识别、杀伤这些靶细胞,因此在体外可将细胞因子基因导入肿瘤细胞,并用放疗将其灭活以作为肿瘤疫苗,再重新输入人体,这些肿瘤疫苗就能促进细胞毒性T细胞增殖,增强抗肿瘤免疫反应。

3.2　神经性疾病基因治疗　基因治疗技术在神经系统性疾病的临床应用中还处于起步阶段,临床上用作复发性恶性神经胶质母细胞瘤手术切除后的辅助治疗手段,但疗效有限。

其他神经性疾病的基因治疗尚处于临床前的研究阶段,包括老年性痴呆症、神经退行性疾病和帕金森氏症等以及神经缺血损伤性疾病、脑中风、脑脊髓损伤后治疗和一些遗传原因所致的较单一的缺乏症等。