1. 将固体淀粉培养基熔化后冷却至50°C左右，无菌操作制成平 板。 2. 用记号笔在平板底部划成4部分。 3 . 将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌 分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在4部分写上菌名。 4 . 将平板倒置在37°C温箱中培养24小时。 5 . 观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘 液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
淀粉水解试验

(二)、明胶水解实验
1. 取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌。 3.将接种后的试管置于20度中培养3~5天。 4.观察明胶液化情况。
穿刺接种
1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针 端灼烧灭菌接着把在穿刺中可能伸入 试管的其他部位，也灼烧灭菌； 4)用右手的小指和手掌边拔出 棉塞。接种针先在培养基部分冷却， 再用接种针的针尖沾取少量菌种。 5)将接种过的试管直立于试管 架上，放在37℃或28℃恒温箱中培 养。24h后观察结果 注意：若具有运动能力的细菌， 它能沿着接种线向外运动而弥散， 故 形成的穿刺线较粗而散、反之则 细而密。
檬酸盐，如产气肠杆菌。 细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合
物，使培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养 基就会由绿色转变为深蓝色。
溴麝香草酚蓝指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在 6.5~7.0时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。
三、实验步骤
（一）、淀粉水解实验
如果不用碘液鉴定淀粉的存在,可以使用斐林试剂来鉴定是否生成了还原性 糖,麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖,淀粉则是非还原性糖.
新配的斐林试剂加入到盛有还原性糖溶液的试管中,混合均匀后, 将试管在沸水浴条件下加热1-2min,就会出现砖红色沉淀.
酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中铅盐或铁盐等，就形成黑 色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。
5.甲基红试验： 甲基红试验是用来检测葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示 剂由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。
尽管所有的肠道微生物都能发酵葡糖产生有机酸，但这个试验在区分 大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。
（五）、甲基红试验
1.将上述两菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。 2.置于37度培养48小时后，将1支培养基内加入甲基红试剂2滴， 培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
（六）、柠檬酸盐试验
1.将上述两菌分别接入2支柠檬酸盐斜面培养基中。 2.置于37度培养48小时后，观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细 菌生长和是否变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。
问题？
1.不利用碘液,怎样证明淀粉水解的存在?
淀粉是逐级水解的,淀粉初步水解产物是麦芽糖,麦芽糖继续水解则水解为 葡萄糖。
淀粉水解是生成葡萄糖的：(C6H10O5)n+nH2O=nC6H12O6 葡萄糖（C6H12O6）是多羟基醛,可用醛的性质进行检验,如银镜试验,有银 白色物质生成；斐林实验,有砖红色沉淀生成.。
尿素琼脂含有尿素葡萄糖和酚红，酚红在pH6.8时为黄色， 而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养 基的pH升高，在pH升至8.4时，指示剂就转变为深粉红色。
4.硫化氢试验： 硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查常
用生化试验。 有些细菌能分解含硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨
这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能 维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、 丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
6.柠檬酸盐试验： 柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸是否被利用。 有些细菌利用柠檬酸盐作为碳源；而另一些细菌不能利用柠
三、实验原理
1.蛋白质水解试验：
微生物 对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生的
胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。
胞外酶主要为水解酶，裂解大分子为较小化合物，使其能被
运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，这过程可
通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液会产生蓝色，在细菌水 解淀粉的区域，用碘液测定时不再 产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2.明胶液化试验： 明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状 态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。 有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而 使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。
3.尿素试验： 尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质分泌在尿液中 的废物，尿素酶能分解尿素释放出氨，这是一个分辨细 菌很有用的诊断试验。 尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但它们利用尿 素的速度比变形杆菌属的细菌要慢，因此，尿素酶试验 被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个 属的成员。
实验九 微生物鉴定中常用的生理生化实验
一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说 明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和 方法。
二、实验材料
1.菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，普通 变形杆菌，产气肠杆菌。 2.培养基 固体淀粉培养基，明胶培养基试管，尿素琼脂试管，醋酸铅培养基， 葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂。
(三)、尿素实验
1.取2支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 3.将接种后的试管置于35°C中培养24~28小时。 4. 观察培养基颜色变化。
（四）、硫化氢试验
1.用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培 养基中。 2.置于37度培养48小时后，观察有无黑色硫化铅的产生。