操作步骤：
➢ 用定量吸管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上。 待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑 去孔内琼脂。
➢ 用毛细管将抗原（血清）加入小孔中，将琼脂 板放入pH8.6, 0.05M巴比妥缓冲液的电泳槽中， 样品孔靠近阴极端，两端用四层纱布搭桥，电 泳时电压可调至110V，电泳45~60分钟。
结果讨论
3、根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征， 对其进行定性分析：
若形成完全相连的两条沉淀线，则相邻两孔 抗原成分完全相同；
若抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；
若抗原部分相同，则形成部分相连的两条沉 淀线；
结果讨论
4、抗原抗体分子量分析 • 若二者分子质量大致相同，沉淀线为一直
线； • 如抗体分子量较大，沉淀线弯向抗体孔； • 如抗原分子量较大，沉淀线弯向抗原孔；
1:4，1:8，1:16，1:32，1:64等不同滴度。并用微量 移液器分别加10μl于周围孔中。 4. 用微量移液器将抗原加10μl于中央孔。 5. 将玻片置于有盖搪瓷湿盒内，隔天观察结果，绘出沉 淀线位置、数量、形态。
操作示意图
浇板
打孔 加样
温育
结果判断 中央孔—抗体成分 周围孔—不同稀释度的抗原 成分（第1~5孔） 第6孔—阴性对照
注意事项：
• 浇载玻片时，琼脂面要尽量铺平 • 打孔要完整光滑，边缘不要破裂，勿使凝胶底
部与载玻片脱离 • 加样时应一次加满，并防止样品溢出孔外 • 加抗原抗体时，要注意更换加样器吸头 • 扩散时间要适当，时间过短，沉淀线不能出现；
时间过长，沉淀线可能解离或散开而出现假阴 性结果 • 37C扩散后，可在冰箱内放置一定时间，沉淀 线会更清晰，以便观察。
AFP、HBsAg等，但敏感度低，所需时间 长。
免疫电泳实验原理
免疫电泳是将电泳技术与双向琼脂扩散相结 合的一种抗原分析方法。根据抗原中各蛋白质组 分的电荷和分子量大小不同，在电场作用下有不 同的迁移率，从而可将混合物中各种不同组分分 开。实验时，将被检抗原样品先放在琼脂板的小 孔中进行电泳分离，再在其平行方向开槽，加入 已知抗体，进行双向扩散。当相应抗原、抗体比 例合适时，即形成白色沉淀线，根据沉淀线的数 量、位置和形态，即可分析样品中所含的抗原成 分及其性质。
结果讨论
1、根据沉淀线位置估计抗原或抗体的相对含 量
• 沉淀线在两孔中间时，抗原浓度＝抗体浓 度；
• 两者浓度不同时，沉淀线靠近浓度低的孔
结果讨论
2、抗原或抗体的纯度鉴定 • 一对抗原抗体系统只形成一条沉淀线； • 含有若干对抗原抗体系统，则因其含量及
分子大小不同，扩散速度不同，可在琼脂 中形成多条沉淀线。
➢ 从电泳槽中取出琼脂板，用刀片按图在两孔之 间挖一小槽，用针挑去槽内琼脂，在槽内加入 抗抗全血清抗体。
➢ 将载玻片置于搪瓷湿盒内，进行扩散24~48小时 后观察结果。
免疫电泳示意图（1）
免疫电泳示意图（2）
免疫电泳的应用
• 大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析 • 正常和异常体液蛋白的识别等方面
沉淀反应
原理：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。
1. --凝胶内沉淀试验： 以琼脂凝胶为介质进行琼脂扩散的一种实验。抗原 抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体 浓度比例适合位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀 环。单向扩散、双向扩散、免疫电泳。
免疫双扩、免疫电泳实验
实验原理
将抗原和抗体分别加到琼脂凝胶板上 的小孔中，使两者相互向对方扩散，经一 定时间后，若两者特异性结合，在琼脂孔 间形成白色沉淀线。
操作步骤
1. 用定量吸管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上。 2. 待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑去孔内
琼脂。 3. 在100μl Ab1中加入100μl生理盐水，依次稀释成1:2，
Ag
Ab
左：抗原分子量较大；中：抗原抗体分子量大致相同；右：抗体分子量较大
结果讨论
5、抗体效价滴定 • 将固定浓度的抗原加入中间孔，周围孔中
加入系列稀释的抗体，以能出现沉淀线的 抗体最高稀释都作为抗体的效价。
1:64
Ag 1:32
1:16
1:2
1:4 梅花孔可确定Ab效价
1:8
应用
• 可用于血清IgG的检测以外； • 还可用于诊断和分析某些疾病，如检测
免疫学技术
主要内容： 1. 抗原抗体的检测 2. 淋巴细胞的检测
抗原抗体反应的原理及特点
1. 特异性 2. 可逆性 3.
抗原或抗体的检测方法
1. 颗粒性抗原------凝集反应 2. 可溶性抗原------沉淀反应
常规方法： 1. 凝集反应、 2. 沉淀反应、 3. 用标记或抗原进行的抗原抗体反应