消毒剂消毒效果的验证组长：***组员：*** ****** ****** ****** ******编号：201412151135版次：2014 年第 1 版目录1．概述 (4)1.1消毒剂 (4)1.2消毒剂使用说明 (4)2．验证目的 (5)3．验证内容 (5)4．验证组织 (6)4.1验证小组 (6)4.2验证委员会 (6)5．验证实施步骤 (7)5.1验证前准备 (7)5.2验证所需文件资料 (7)5.3悬液法定量杀灭试验 (8)5.4对裸手消毒效果试验 (10)5.5消毒剂对佩戴手套后的消毒效果验证 (13)5.6消毒剂对物体表面消毒效果验证 (17)5.7消毒剂消毒效果验证结论 (22)6．验证主要依据 (22)7．验证合格标准 (22)7.1判断标准 (22)7.2现场考察试验合格标准 (22)8. 再验证周期 (23)附录 (23)附录一验证方案会审记录 (23)附录二验证方案修改申请及批准书 (24)附录三漏项和偏差处理记录 (25)附录四悬液法定量杀灭试验记录 (26)附录五消毒剂对佩戴手套后人员手现场试验记录 (32)1．概述1.1 消毒剂消毒剂的作用原理：破坏细胞膜类，阻断细胞食物摄取和废物排泄，钝化关键酶。
以下是几种常用的消毒剂：（1）新洁尔灭(苯扎溴铵)：是一种常用的季铵盐类消毒剂，在浓度较低时即可有抑菌的作用；当浓度较高时，可以杀灭多种细菌繁殖体和部分的病毒，但是不能杀灭细菌芽孢，属于低效消毒剂。
（2）75%乙醇：适用于一般物体表面消毒以及手和皮肤的消毒，它无法杀灭细菌芽孢和病毒。
（3）优洁：属于长效、强效、广谱杀菌剂，是一种新型消毒剂，其有效成分为复合季铵盐和六亚甲基四胺，可有效快速地杀灭细菌繁殖体、芽孢、真菌和部分病毒等，各种微生物对其均无抗药性，抑菌时间较长，可用于一般物体表面消毒，稳定性好，无腐蚀性，无毒无害，并且由于杀菌时不受蛋白质及有机物的干扰，故使用衰减周期长，可循环使用，相对使用成本低。
本次验证以优洁消毒剂的杀灭效果为主，同时也可根据此验证方案对75%乙醇、新洁尔灭等消毒剂的杀灭效果进行评价。
1.2 消毒剂使用说明对于不同的消毒对象，应使用不同的消毒剂，并制订消毒程序，消毒程序中应明确规定：（1）消毒剂的浓度及配制方法；（2）消毒剂使用的条件；（3）消毒使用的设备、设施；（4）消毒操作的详细步骤；（5）消毒周期；（5）消毒效果的监测方法。
制订的消毒程序的消毒效果应经过验证后，才能批准使用。
本验证具体规定了评价消毒剂消毒效力的生物学检测方法及其效果评价方法。
2．验证目的药品在生产过程中会遭到来自微生物的污染，因此必须要采取一定措施使微生物污染处于受控状态或者完全被消除，这就需要对消毒剂消毒效果进行验证以确定相应的方案来处理这些问题。
在对消毒剂进行消毒效果验证的过程中，主要是要用特定的微生物与消毒剂在规定的使用浓度下接触规定的时间后，对微生物进行培养计数，考察该消毒剂的消毒效果，确定消毒剂消毒后的最长有效时间，并对消毒剂对微生物的杀灭效果进行评价。
确认洁净区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交叉污染的目的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。
本次验证以优洁消毒剂的杀灭效果为主，同时也可根据此验证方案对75%乙醇、新洁尔灭等消毒剂的杀灭效果进行评价。
3．验证内容消毒剂消毒效果验证包括两项考察：实验室考察和现场考察。
实验室考察通常以悬液定量法为主，且试验须重复3次，而现场考察可用来评估消毒剂对相应设施的实际消毒效果。
在消毒剂消毒效果试验中，消毒方法和消毒对象有很多。
常用的方法有：喷洒法，浸泡法，擦拭法等。
常见的对象有：皮肤，洁净区的地面、墙面，设备表面等。
此次试验我们采用的消毒方法为喷洒法，消毒对象为人员裸手皮肤、人员佩戴无菌手套后的手套表面和物体表面。
根据消毒对象所制定相应的试验方案有：悬液法定量杀灭试验、消毒剂对裸手消毒现场试验、载体喷雾定量杀菌试验、消毒剂对佩戴手套后的手消毒现场试验以及消毒剂对物体表面现场鉴定试验。
通过以上几种试验来对消毒剂消毒的效果进行验证。
4．验证组织4.1 验证小组表4-1 验证小组及职责4.2 验证委员会4.2.1人员组成：由企业质量副总、生产副总及生产部、质量保证部、质量检验部、设备动力部经理或主管组成。
4.2.2职责：负责验证方案的审批；负责验证的协调工作，以保证验证方案的顺利实施；负责验证数据及结果的审核；负责验证报告的审核；负责确定该项验证的再验证周期；负责验证证书的发放。
5．验证实施步骤5.1 验证前准备在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经验证合格并正常运行，设备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告、空气净化系统操作程序；与验证相关的各种设备、仪器均需通过相应验证，所需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书。
5.2 验证所需文件资料表5-1 验证所需的文件资料及存放处活菌数检测操作规程ZL-03-066 GMP办公室菌落计数操作规程ZL-03-070 GMP办公室培养基配制操作规程ZL-03-073 GMP办公室培养基配制、使用管理规程ZL-03-110 GMP办公室消毒剂配制操作规程WS-04-029 GMP办公室消毒剂的使用操作规程WS-04-030 GMP办公室致病菌阳性菌株传代操作规程ZL-03-075 GMP办公室实验器具清洗操作规程ZL-03-087 GMP办公室实验器具灭菌、消毒及使用操作规程ZL-03-088 GMP办公室进出微生物限度实验室操作规程ZL-03-259 GMP办公室CHK型显微镜操作规程SB-03-153 GMP办公室厌氧罐操作规程SB-03-156 GMP办公室MS1型振荡器操作规程SB-03-381 GMP办公室BL610型电子天平操作规程SB-03-324 GMP办公室SKP-02B型电热恒温箱操作规程SB-03-375 GMP办公室SKP-02B型电热恒温箱清洁规程SB-03-376 GMP办公室微生物实验室清场操作规程ZL-03-064 GMP办公室破伤风杆菌检测操作规程ZL-03-220 GMP办公室DELTA-320PH计操作规程SB-03-234 GMP办公室致病菌阳性菌管理规程ZL-03-112 GMP办公室微波炉的操作规程SB-03-177 GMP办公室洁净区情场操作规程ZL-03-112 GMP办公室设备清洁操作规程SB-03-187 GMP办公室5.3 悬液法定量杀灭试验5.3.1 试验所需要用的试剂中和剂：0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液（0.9%N.S）活菌计数用培养基：TSA培养基稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS 0.03mol/L消毒剂配制用水：纯化水有机干扰物质5.3.2 试验所需要用的仪器移液器、电动混匀器、计时器、生化培养箱5.3.3 试验所需要用的菌种可根据《消毒技术规范》2008年版[4]“细菌定量杀灭试验”中指导，本次试验选择金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。
再增加车间常见的菌：洋葱伯克霍尔德菌。
5.3.4 试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间根据优洁消毒液说明书建议浓度为1%-3%，作用时间为1-2min，但根据厂家验证报告0.1%及0.2%的浓度作用5min和15min也能符合规定，因此本次试验浓度选择0.2%，作用时间选择2.5min、5min以及7.5min的条件进行确认，又因车间裸手消毒作用时间可能只有30s，故本次试验同时对0.2%消毒剂作用15s、30s以及45s的条件进行确认。
5.3.5 试验所需要用到的场所微生物实验室阳性间5.3.6 悬液定量杀菌试验操作程序（1）菌悬液：浓度为1×108cfu/ml-5×108cfu/ml（2）消毒液的配制：用纯化水按体积比配制浓度为0.2%的消毒液500ml（3）磷酸盐缓冲液的配制：磷酸盐缓冲液（PBS 0.03mol/L）称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g加入到1000ml蒸馏水中，待完全溶解后，调PH至7.2-7.4，灭菌后使用。
（4）有机干扰物质的配制：按30g牛血清白蛋白中加入1000ml蒸馏水的比例配制约100ml，溶解后用0.45um的无菌滤膜进行过滤除菌后使用，未用完的可于2-8℃冰箱中保存。
（5）试验过程（以浓度为0.2%优洁消毒剂对金黄色葡萄球菌作用2.5min为例）试验组：取无菌大试管加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液，再加入0.5ml的有机干扰物质，分别用无菌吸管吸取0.2%的优洁消毒液4.0ml，加入试管中，迅速混匀并立即计时。
待金黄色葡萄球菌与0.2%的优洁消毒液相互作用2.5min时，吸取0.5ml试验菌与消毒剂的混合液，加于4.5ml经灭菌的0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液中，混匀。
金黄色葡萄球菌与消毒剂混合液经硫代硫酸钠-生理盐水溶液作用10min后，吸取1.0ml样液，按活菌培养计数测定方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿即可。
如果菌液浓度较高时，可进行10倍系列稀释后，在进行活菌培养计数，作为试验组，其计数结果为C X。
阳性对照组：用4.0ml磷酸盐缓冲液代替4.0ml0.2%的优洁消毒液与0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液、0.5ml有机干扰物质混合2.5min后，取0.5ml混合液与4.5ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液反应，作用10min后。
计数方法同试验组，计数结果为C0。
阴性对照组：吸取此次试验用的纯化水0.5ml、0.5ml有机干扰物质、4.0ml磷酸盐缓冲液混匀，混匀后取0.5ml混合液与4.5ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液作用10min后，吸取1.0ml混合液，按活菌培养计数测定方法测定存活菌数，作为阴性对照。
培养：所有用细菌试验的样品均放入30-35℃培养箱中培养，培养48小时观察结果；用真菌试验的样品放入23-28℃培养箱中培养，培养72小时观察结果。
5.3.7 试验要求作用于不同试验菌不同作用时间后的消毒效果试验均须进行3次，每次进行时应注意所用的试剂等物品均应重新配制，防止系统误差的发生。
5.3.8 活菌计数结果应换算为对数值（N）按计算公式杀灭对数值KL=阳性对照组平均浓度对数值（N0）-试验组活菌浓度对数值（N X）。
计算杀灭对数值的时候，取小数点后两位值，可以进行数字修约。
如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。
5.3.9 判断标准阴性对照应无菌生长；细菌各次试验的杀灭对数值均应≥5.00，可判断为对细菌消毒合格；真菌各次试验的杀灭对数值为≥4.00，可判定该产品对真菌污染物消毒合格。