人们一般认为： 1 个分子SDS 可通过其烷基与蛋白质分子中
2 个氨基酸残基相结合
蛋白质化学一级结构测定
（三）氨基酸组成成分分析
为什么要求做氨基酸组成成分分析？
如果知道了某蛋白质的分子量，再 知道了它的氨基酸组成成分及其含量， 就能够大致了解到蛋白质分子中各种氨 基酸残基的个数。
蛋白质化学一级结构测定
蛋白质化学一级结构测定
• 肽链末端分析
通过肽链末端（N-端，或C-端）的分析，就 能够知道蛋白质分子中肽链组成的大概情况。
如： 测定胰岛素单体，发现有2个N-末端（Gly， Phe）和 2个C-末端（Asn，Ala），那么，就可 以推测胰岛素单体可能是有二条肽链内部通过 二硫键相联而组成的。
蛋白质化学一级结构测定
氨基酸组成分析的步骤
• 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括 3个步骤，即：
1
பைடு நூலகம்水解
在一定温度、酸 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂，水解成 游离氨基酸。
2
衍生
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
3
色谱
利用色谱对这些 氨基酸进行定性 和定量分析。
• 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或 摩尔比。
（一）游离N-末端测定 1 二硝基氟苯(DNFB)法
碱性条件下反应
水解 16-24 h DNP-氨基酸蛋白质化学一级乙结构醚测抽定 提后层析分析
碱性条件下反应
盐酸水解
DNS-氨基酸
可直接点样后通过聚酰胺 薄膜层析进行分析鉴定
蛋白质化学一级结构测定
注意：
DNS-Cl和DNS-氨基酸在酸性条件下水 解，会形成DNS-OH 和DNS-NH2，但在紫外 线照射下， DNS-氨基酸发出绿色荧光， 而DNS-OH发出蓝色荧光，DNS-NH2发出蓝绿 色荧光。
英国科学家 F. Sanger等人 用了10多年时间，于1954年首次完成了 牛胰岛素一级结构（51个氨基酸残基） 的测定工作。
蛋白质化学一级结构测定
美国科学家 S.Moore 和 W.H.Stein等人用了5 年时间，应用Edman反应和离子交换技术， 于1960年完成了牛胰核糖核酸酶一级结构（124 个氨基酸残基）的测定工作；
蛋白质化学一级结构测定
1965年，我国科学工作者成功合成了 牛胰岛素。
A、B链
蛋白质化学一级结构测定
胰岛素：
胰脏胰岛分 泌的激素
----由21个氨 基酸残基的A链 和30个氨基酸 残基的B链通过 3个二硫键连接 而组成的蛋白 质分子。
蛋白质化学一级结构测定
三聚体 六聚体
（2） 一级结构测定简况
--让蛋白质变性后再分离鉴定；
（2）以-S-S-连接的肽链 --加入β-巯基乙醇等还原剂后再分离鉴定
蛋白质化学一级结构测定
常 见 的 变 性 剂
蛋白质化学一级结构测定
十二烷基硫酸钠与十二烷基磺酸钠
两种物质都是阴离子表面活性剂，其中十二 烷基硫酸钠是常用的生化和免疫实验用试剂。
蛋白质化学一级结构测定
(3)与功能密切相关的氨基酸残基是不变的， 与生物进化相关的氨基酸残基是可变的。
蛋白质化学一级结构测定
一 概况
1、一级结构（初级结构） 主要指多肽链中氨基酸的排列顺序，但还包
括其连接方式以及二硫键位置。
2、一级结构的分析和测定
（1）确定多肽链中氨基酸的连接方式是肽键 结构的实验依据：
蛋白质化学一级结构测定
此外，DNS-Cl法中DNS-氨基酸比 DNFB法中DNP-氨基酸在酸性条件下水解的 稳定性要大得多 ！
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3 异硫氰酸苯酯（PITC）法 （ Phenylisothiocyanate）
碱性条件下反应
25%三氟乙 酸水溶液
苯氨基硫甲酰多肽 （PTC-蛋白）
无水三氟乙 酸下裂解
（其他肽键 不断裂 ）
目前，有关测定方法更加 微量化、自动化、 快速化，在1个月内就能够完成100多个氨基酸 残基组成的蛋白质一级结构测定工作。
应用质谱分析技术来分析蛋白质序列可以做 到更微量化、快速化。
蛋白质化学一级结构测定
二 一级结构测定基本思路和程序
基本思路与程序： 分离纯化蛋白质， 特定位点降解多肽链， 分离小肽段 分析鉴定小肽段氨基酸序列， 排出所有小肽段氨基酸序列， 比较重叠（接头）肽氨基酸序列， 确定整个多肽链氨基酸序列。
级结构完全知道以后才能达到！
蛋白质化学一级结构测定
（二）蛋白质分子量和多肽链数目的确定
• 分子量的测定
分子量测定方法主要有： 凝胶过滤法 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （SDS-PAGE）等（测定的误差不超过10%） 离心沉降法
蛋白质化学一级结构测定
• 蛋白质分子中多肽链数目的确定
如何确定？ 有两种连接情况： （1）以非共价键联系的肽链
a 蛋白质水解产物是氨基酸
b 寡肽与蛋白质均呈现双缩脲反应
NH2 CO
碱性
NH CO
+ CuSO4
NH2
双缩脲
紫红色 络合物
蛋白质化学一级结构测定
c 人工合成寡肽和多肽的成功 1902年，合成二甘肽； 1908年，合成十八肽； 1953年，合成催产素：
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly
乙酸乙酯抽提后层析法分析
苯基乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸） （ Phenylth蛋i白o质hy化d学a一n级t结o构in测a定mino acid ）
以上的方法都是化学法 能否用酶法测定 ？
第三章 蛋白质一级结构及其测定
蛋白质化学一级结构测定
2008年全国硕士生植物（动物）生理学 与生物化学入学考试题
生物化学部分
六 简答题
38 简述蛋白质的一级结构及其与生物进
化的关系
蛋白质化学一级结构测定
(1) 蛋白质一级结构是指蛋白质多肽链中氨 基酸残基的排列顺序及二硫键的位置。
(2) 不同物种同源蛋白质一级结构存在差 异，亲缘关系越远，其一级结构中氨基酸 序列的差异越大;亲缘关系越近，其一级结 构中氨基酸序列的差异越小。
蛋白质化学一级结构测定
三 测定前期准备工作 （一）分离、纯化蛋白质
提取以及纯化蛋白质的工作是一件费时、 费力、很不容易的工作。
通常情况下，要求杂蛋白含量不能超过3%。
蛋白质化学一级结构测定
（二）蛋白质分子量和多肽链数目的确定
为什么要测定一下蛋白质分子量 ？
蛋白质分子量如何进行测定？
• 分子量的测定 精确知道蛋白质的分子量，只有在其一