500 13.501
H1975 1%
23.144
500 15.077
500 14.947
500 15.046
500 13.763
H
NTC
NTC
NTC
NTC
H1975 0.1% NA
102 17.684
102 17.424
102 17.410
102 16.571
NTC
20-M1 103
16.397
102 17.465
环境条件
各区独立、注意风向 因地制宜、方便工作
实
仪器设备
建立档案、维护、
验
定期校准
室
试剂耗材
建立档案、性
方法学
规
能验证、质检
验证
范
人员技术
技术培训
能力
能力考核
质量控制
室内质控 室间质评
何时需要进行方法学验证
z 新项目开展之前； z 新增或者变更原有项目的检测仪器； z 更换试剂品牌
……
方法学验证现状
灵敏度
z 分析灵敏度（确定检测方法的检测下限）：将已知定值的标准品，用野生型的 基因组稀释突变型基因组，设定常见/所有突变类型的不同的突变含量，一直稀 释到检测下限以下为止，最低稀释浓度即为该方法的检测下限,每个浓度梯度重 复检测2-3次。（根据实际情况在最低稀释浓度附近进行10倍以下的稀释）
z 确立灵敏度的检测：５个梯度，２个重复
103 13.874
E18-M1
103 13.608
F20-M2
103 13.976
G21-M2
103 13.074
H1975 25% 18.098
103 13.716
103 13.464
103 13.714
103 12.531
H1975 5%
20.549
500 15.088
500 14.789
500 14.724
1 23.502
1 NA
1 23.809
20-M1
1
STD NTC
27.837
1 STD NTC
25.757
1 STD NTC
26.830
1 STD NTC
23.929
1 STD NTC
23.559
NTC
NTC
NTC
NTC
NTC
STD NTC
灵敏度
可稳定检出10ng DNA样本中含量低至1% 的EGFR基因突变。
10
基因突变的检测方法
z Southern印迹法 z Sanger测序法 z ARMS法 z 液相芯片法 z DHPLC法 z 二代测序法………
方法学验证的性能指标和方法相同，以ARMS为例介绍
检测EGFR基因突变的方法学验证
z 扩增阻碍突变系统（ARMS）是PCR技术应用的发展，用 于对已知突变基因进行检测。
1 23.422
1 STD NTC
23.769
BH1975
50% 17.348
50% 16.887
25% 18.334
25% 18.010
5% 20.825
5% 20.936
1% 23.916
1% 22.962
0.1% 26.015
0.1% STD NTC
25.748
H1975
C
50%
16.754
D20-M3
方法学验证的步骤
一．方法学验证设计阶段 二．实验数据收集阶段 三．数据统计、结果判断阶段
——每个实验室应有自己的数据
方法学验证-设计阶段
z 最为关键!!
实验对照 方法
实验前后 顺序
实验步骤
结果统计方式 及判断标准
实验 设计
检测位点
标本数量 性能参数 样本浓度
灵敏度 特异性 准确性 精密度 准确度 参考范围 干扰试验 可报告范围
2ng/µL的EGFR基因野生型的人基因组DNA
S1
103
5*102 102
10
1 copy/μL
灵敏度
z 选择的阳性质粒质控品为：19-M2（E746_A750del (2) ），20-M1（T790M），20-M3/5（H773_V774insH） 、 18-M1 （ G719A ） 、 20-M2 （ S768I ） 、 21-M2 （ L861Q）；H1975 细胞系（为L858R和T790M突变细 胞系）。
8
方法学验证-实验数据收集阶段
z 严谨！！
注意：
z 具体操作人员必须对检测系统非常熟悉 z 方法学验证试验必须在实验室由实验室人员完成，不 能由厂家技术人员操作 z 每次必须做室内质控
9
方法学验证-数据统计、结果判断阶段
z 明确、客观，杜绝虚假报告 z根据质控品判断PCR扩增的有效性，只有当质控品 的扩增结果符合项目SOP有关条件时，才可判读， 否则应重新测定
特异性
z 特异性的验证主要是确认该方法的假阳性率，特异性 =[TN/(TN+FP)] × 100% （ TN=true negative 、 FP=false positive）。
z 选择原则：适量、方便、说服力
灵敏度
阳性质 控品
1
S1 2
A19-M2
103 13.460
103 12.240
3 S2 4
500 14.059
500 14.105
5 S3 6
102 16.865
102 16.997
7 S4 8
10 20.041
10 20.178
9 S5 10
阳性11 对照
阴1性2 对照
102 17.740
102 17.611
102 16.786
20-M1 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ00
17.982
10 21.271
10 21.188
10 21.898
10 20.585
20-M1 102
20.120
10 20.890
10 20.876
10 21.961
10 20.443
20-M1 10
25.204
1 25.485
基因突变检测的方法学验证
2015年8月30日
分子病理诊断将成为个体化治疗 的重要内容
个体化治疗是根据临床、病理及分子差异实施不同的治疗方案，是疾病 治疗尤其是肿瘤治疗的重要模式和发展方向。
基因检测原则
z分析合法性 z临床合法性 z临床实用性
实验室规范保证准确性、可靠性、可溯源性
实验室工作规范
z 试剂盒（荧光PCR法）、阳性质粒质控品
z 相关性能参数包括：灵敏度、特异性、准确性、精密度、 准确度。每次PCR反应中，同时进行阳性质控品（STD）和 阴性对照（NTC）的检测，确认质控结果满足接受标准。
z 验证本实验室用于人类EGFR基因突变ARMS检测系统的 性能参数能与厂家已建立的性能指标具有可比性，并适合于 本实验室检测的患者群体。
z CAP和ISO15189都强调：新的检测方法应用到患者临床诊 断之前必须进行方法学验证
z上海地区分子诊断技术审核办法也明确规定需对申请的项 目完成方法学验证
z方法学验证一直是分子检测行业比较薄弱的部分
z 对验证的概念和具体实施存在模糊之处
通过了CFDA注册的仪器、试剂就不用进行性能验证？ 拟开展新项目的实验设计未按相关标准开展 性能参数验证不完善 由厂家完成验证全过程？ ……