分子生物学综合性实验结题报告绿色荧光蛋白基因左xx1学 10110902014 10110904007 班 10G20专生物制药学生物医药摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。
本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification.Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；1..引言 ------------------------------5页2..应用前景 ------------------------------6页3..分子生物学实验原理 ------------------------------8页4..实验材料及试剂 ------------------------------12页5..实验流程 ------------------------------13页6..实验结果 ------------------------------19页7..分析 ------------------------------21页参考文献 -------------------------------22页致谢 ------------------------------ 23页附录 -------------------------------24页绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于水母﹑水螅何珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,这种蛋白质最早是由普林斯顿大学的科学家下村修（Osamu Shimomura）等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
现今科学家已经成功地将绿色荧光蛋白基因表达在E.coli及线虫等异源细胞中, GFP在各种异源细胞如,细菌﹑昆虫﹑动物及植物细胞中发现。
本实验通过基因工程手段，将存储在含有pEGFP-N3的GFP基因连接到载体pET-28ａ的启动子区构成重组体，最后在表达菌BL-21中完成GFP基因的表达，结果能成功的观察到GFP发出的荧光。
2 应用前景在2008年的诺贝尔化学奖上，绿色荧光蛋白成了主角。
诺贝尔获奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁•查尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。
在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，只见这支试管中的物质发出了绿色荧光。
2.1生物技术中的应用研究2．1．1．分子标记作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。
利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFPGFP标记的微管基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。
1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。
研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。
利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。
2.1.2．药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。
基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。
荧光探针c为药物筛选的GFP分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。
由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。
2.13融合抗体近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。
单链抗体（Single-chain vGFP在植物研究中的应用ariable fragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。
近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。
因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。
绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中3 分子生物学实验原理3.1 DNA重组技术DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合，把外源目的基因装配到载体上的过程。
包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。
体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。
3.2 DNA片段和载体的连接（1）带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。
由于质粒载体也必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外源目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化，而且正反两种连接方向都有。
为防止载体DNA自身环化，连接前用碱性磷酸脂酶（CIP）去除载体分子的5’-P，使之最大限度地抑制载体环化现象。
（2）带有非互补的粘性末端：用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生这样的末端，一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶切位点；用两种酶分别消化载体和目的DNA后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。
（3）带有平末端：由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶Klenow片段补平3’凹陷，使不相匹配的末端转变为平端。
由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA浓度均要高得多。
通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
（4）成功的连接反应需纯净的目的DNA片段和载体DNA，一般采用插入片段（目的DNA）与载体DNA分子数比为3～5：1。
目的基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体。
3.3绿色荧光蛋白基因重组步骤本实验将通过限制性内切酶双酶切法将EGFP片段从该质粒中克隆出来，并转入另一常用表达载体Pet28a。
在质粒酶切验证后，得到含有EGFP的阳性克隆，并将EGFP蛋白在E.coli BL21菌株中进行表达，最后，所表达的EGFP蛋白可以通过SDS-PAGE法得到验证。
BamHⅠNotⅠBamHⅠNotⅠ回收回收DH5a(pEGFP-N3)DH-5a(pET-28a)质粒pEGFP-N3质粒pET-28a插入片段4 实验器材与试剂4.1实验仪器恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱，1.5mLEP管，0.5mLEP管，塑料离心架，微量加样器各一个，三角瓶，培养皿，电泳仪,玻璃刮刀，制冰机，紫外仪，电子天平，高压灭菌锅。
4.2实验材料及试剂E．coli DH5a包括含有pEGFP质粒的DH5a菌株，含有Pet-28a（+）质粒的DH5a 菌株和空载的DH5a以及E．coli BL21(DE3)菌株，含Kan的LB液体培养基，LB固体培养基，溶液Ⅰ（GET缓冲液ph8.0），溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,SDS），溶液Ⅲ（乙酸钾溶液，ph4.8）酚-氯仿，TE缓冲液，异丙醇，70％乙醇，无水乙醇，BamhⅠ、XhoⅠ和NotⅠ酶切试剂，0.1mol/L CaCI2溶液(灭菌)。
(1) 液体LB培养基（PH 7.0）蛋白胨（10 g/L）1％酵母提取物（5 g/L）0.5％NaCl （10 g/L）1％（固体LB培养基是在液体LB的基础上中加琼脂粉2%）(2) 溶液Ⅰ（0~4 ℃贮存）葡萄糖50 mmol/LTris-Cl(pH 8.0) 25 mmol/LEDTA (pH 8.0) 10 mmol/L(3) 溶液ⅡNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)（用时由母液2 mol/L NaOH、10 % (W/V) SDS稀释现配）(4) 溶液Ⅲ（0~4 ℃贮存）乙酸钾(5 mol/L) 60 mL冰乙酸11.5 mLH2O 28.5 mL(5) 0.5×TBE电泳缓冲母液（500 mL量）Tris-碱 2.7 g硼酸 1.4g0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 1mL(6) 6×DNA电泳缓冲液溴酚蓝0.25 %蔗糖水溶液40 % (W/V)(7) 卡那霉素（Kan）配成浓度为50 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用。