知识介绍绿色荧光蛋白马金石(中国科学院化学研究所 北京 100190)摘 要 绿色荧光蛋白是46多年前从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。

由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领域。

本文简要介绍了水母发光蛋白与绿色荧光蛋白的关系、绿色荧光蛋白的结构、发色团的形成、发光机制、变异体以及它的特点和应用。

关键词 绿色荧光蛋白 基因表达 结构 发色团 生物发光Green Fluorescent ProteinMa Jinshi(Insti tute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190)Abstract Green fluorescent protein(GFP)was discovered46years ago from A equorea V ictoria,it can emit green light under exci tation of blue or UV irradiation.GFP as a marker for gene expression and localization of gene products has beenwidely used in life sciences for the past years because of its stable structure and photophysical property and easy expressionin cells.A brief introduction on the relationship of aequorin and GFP,GFP structure,chromophore formation,and the mechanism of bioluminescence,also the variants,characteri stic and application are presented in this paper.Keywords Green fluorescent protein,Gene expression,Structure,Chromophore,Bioluminescence由于对绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁 沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔化学家钱永健(Roger Y Tsien)。

化学奖评选委员会主席贡纳尔 冯 海伊内和评委莫恩斯 艾伦贝里对绿色荧光蛋白的评价指出,这是当代生物学的重要工具,借助这一 指路标 ,科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法,这在以前是不可能实现的。

他们说,下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质,即GFP。

随后,马丁 沙尔菲在利用GFP做生物示踪分子方面做出了贡献;钱永健让科学界更全面地理解GFP的发光机理,对GFP作了改造,通过改变其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色(蓝色、蓝绿色和黄色)光的荧光蛋白,为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。

我国在生命科学领域已经广泛应用GFP,对它的介绍和应用的文章也有很多[1~6]。

国外的综述可阅读钱永健和Zimmer的文章,最新的是Shaner等的文章[7~9]。

化学界对它的了解可能较少,在此做个简单介绍。

1 生物发光与水母先从生物发光说起,生物体的发光现象称为生物发光。

植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇,动物界从原生动物到脊椎动物都有,脊椎动物中主要是鱼类。

从发光生物的分布来2008 10 25收稿,2008 11 04接受看,海产多,陆地上见得最多的是萤火虫。

深海中太阳光照射不到,一片黑暗,自身发光是彼此传递信息的唯一来源。

深海中缺乏海洋植物,无海藻可吃,要维持生命就靠 大鱼吃小鱼 , 弱肉强食 养活自己。

因此自身发光的作用就显得非常重要。

1885~1887年,Dubios首先从磕头虫(Click bettle,Pyrophorus)和蛤(Clam,Pholas dactylus)中发现了对热稳定的荧光素(luciferin)和对热不稳定的荧光素酶(luciferase)。

荧光素是一种小分子有机化合物,生物发光过程就是荧光素在荧光酶存在条件下被氧化成处于激发态的氧化荧光素(oxyluciferin),激发态回到基态时就发出光和得到氧化荧光素。

荧光素+O2(或H2O2)荧光酶[激发态氧化荧光素]*氧化荧光素+光不同的发光生物具有不同的荧光素和荧光素酶。

生物发光是将化学能转化为光能,可以认为是一种化学发光。

陆产和淡水产的发黄绿-橙黄色光,海产的一般发蓝光,由于蓝色光比其他颜色传播得更远,在水中容易被感知,因此是海洋生物发光的首选。

海洋生物中,对腔肠动物(coelenterate)中的软体珊瑚虫海肾或称海三色紫罗兰(Sea Pansy Renilla reniformis)、水母纲的多管水母Aequorea victorin研究得比较多。

水母的整体或分离出的颗粒是发绿光的。

科学家首先从多管水母身上分离出了水母发光蛋白(aequo rin),其分子量为20kDa,它在遇钙离子以后发射波长460~470nm的蓝光。

每只水母平均只含50 g的这种物质。

aequorin是水母荧光素(coelenteragine,结构如右)通过硫酸酯键或过氧化键紧紧地连到脱辅水母发光蛋白(apoaequorin)上形成的,它遇到钙离子就发蓝光,因此可以用它作为钙离子的检测试剂,发光后的产物是脱辅水母发光蛋白,C O2和氧化荧光素(colentera mide),见图式1。

与其他发光生物不同的是,aequorin发出的蓝光,通过F rster共振能量转移将能量传给水母体内的GFP,发出波长509nm 的绿光,所以水母在整体发光时发绿光。

图式1 水母发光蛋白的组成和发光过程Scheme1 Composition and bioluminescence of aequor in关于发光生物(包括水母)荧光素的发光机理在此不作更详细介绍,有兴趣者可阅笔作者在 生物有机光化学 一书中的介绍和其他文献[1]。

2 绿色荧光蛋白(GFP)2 1 GFP的结构下村修等1962年首先从太平洋多管水母(图1)中分离出来了GFP[10]。

它是一种天然的纳米粒子(图2),大约8~10nm,呈圆筒形折叠。

在晶体中或在离子强度低于100mmol L的溶液中两个原体形成二聚体。

二聚对于GFP的激发光谱和能量传递是有作用的。

为了有效地传递能量,二聚体和水母发光蛋白有生理相互作用[11,12]。

图1 维多利亚多管水母Fig.1 Aequorea victorin图2 绿色荧光蛋白Fig.2 G reen fluorescent protein(GFP)图3 GFP 折叠布局[14]Fig.3 The topology of the GFP fold ing pattern [14]圆筒外边11条链形成结构的外壁。

圆筒直径3nm 长4nm 。

螺旋小的片段在圆筒的末端形成筒,一个不规测的 螺旋片段作为一个支架可以提供给发色团,使其坐落在圆筒的中心。

片层状的链彼此牢牢地固定,像支撑桶的棒。

结构形成一个密集体,没有开口。

这种折叠的模式是 片层状在外, 螺旋在内,是一种新的蛋白类型,命名为 罐(beta can )[11~13]。

图3给出了GFP 折叠的布局。

从C 末端除去多于7个的氨基酸或者从N 末端除去带蛋氨酸的片段就没荧光了,没荧光的变异就不会表现出整个发色团的吸收光谱特征。

最后的7个残基无序,在圆筒的外边弯回来,不构成筒的外壁,它们的存在不是必需的,另外再加一些残基也没关系。

至于N 末端,在圆筒内的第一条蛋白链开始于残基10,筒的形成不需要N 末端部分。

N 末端片断是在蛋白的一头的帽子的主要成分,是折叠的,可以保护发色团。

在N 末端延伸不会破坏蛋白的结构。

非常紧密牢固的筒状结构和发色团所处的中心位置,都可以说明发色团被严格保护,性质稳定。

荧光不会由于和氧的相互碰撞而被猝灭,使得量子产率降低。

由于结构的关系通过系间窜越形成单重态氧而遭光化学损伤的几率也降低了。

GFP 由238个氨基酸组成,分子量约28kDa,组成发色团蛋白的3个残基Ser dehydroTyr Gly(丝 脱氢酪 甘)位于65~67位,经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮,它可以被光激发产生荧光(图式2)。

野生水母GFP 的最大吸收 激发波长在395nm,一个小峰在475nm,摩尔消光系数分别为30000和7000mol -1c m -1,发射峰在509nm(图4)[15~20],GFP 晶体的荧光光谱和GFP 水溶液的荧光光谱基本相同。

虽然氨基酸序列Ser dehydro Tyr Gly 在不少蛋白中也存在,但不是环化的,酪氨酸也不是被氧化的,更不会发光。

说明能形成发色团不是这三肽的固有特性。

在GFP 中,发色团的形成经系列自催化过程,既无辅助因子也没有酶介入。

首先是Ser65和Gly67快速环化形成咪唑啉 5 酮中间体,然后O 2慢慢氧化Tyr66的图式2 G FP 发色团的分子结构S cheme 2 T he molecular structure of GFP chromophore图4 GFP 的吸收 激发和发射光谱[19]Fig.4 Abs orption excitation and emission spectra of GFP [19]侧链,这个过程要几个小时(图式3)。

形成发色团需要Gly67,没有任何一个氨基酸可以取代Gly 。

反应对热敏感,温度高于30 时产率下降。

一旦形成GFP,它就是热稳定的。

图式3 形成发色团的生物合成过程Scheme 3 Biosynthetic scheme for the chromophoreGFP 的发色团很稳定,用酸、碱、盐酸胍使蛋白变性,一旦恢复中性或除去变性剂,又可以恢复发光性能。

2 2 GFP 发光机制水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP 发出绿光,见图5。

水母发光蛋白Ca 2+脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光绿色荧光蛋白蓝光绿光图5 水母发光蛋白由于钙离子的激活,发射蓝光(470nm),被GFP 吸收发射绿光(509nm)[21]Fig.5 Aequorin is activated by Ca 2+,emitting b lue light(470nm).In vivo an energy trans fer from the excited state ofthe coelenteram ide to G FP,emitting the green fluorescence(509nm)[21]图6 能量传递过程的F rster 循环Fig.6 F rster cycle within the core of a protein 水母发光蛋白上连接着荧光素,遇钙离子后发蓝光,经共振能量传递诱发GFP 发光,整个过程形成F rster 循环,GFP 是第一个知道的在蛋白核心的F rster 循环的例子[11,12]。