三、减毒活疫苗的研究策略
①选择标准的疫苗株; ②新的抗原结构能诱导广泛的中和抗体; ③诱导在多样主要组织相容复合体(major histocompatibility complex， MHC)背景人群 的多位点的CTL应答;
④直接和间接地诱导传播途径的黏膜免疫应 答
1.病原体的培养
如何减毒？
• 体外细胞培养
• 只有选择突变遗传性能稳定的菌毒株，才能最
大限度地防止其使用过程中毒力返祖的可能。
4. 生产适应性
• 易于培养
• 便于规模化生产
• 有利于生产工艺流程的可操作性和简化
• 有利于保证产品的产量和质量。
二、减毒活疫苗制备技术要求
1. 基本要求
①设施与生产质量管理——中国《药品生产质量管理 规范》 ②原、辅料:《中华人民共和国药典》、《中国生物 制品主要原辅材料质控标准》 ③纯化水和注射用水： 《中华人民共和国药典》 ④生产用器具:必须清洗干净、灭菌处理。 ⑤生产及检定用动物:
第二节 减毒活疫苗设计与制备 的技术要求
一、减毒活疫苗的设计要求
设计减毒活疫苗菌株或毒株，要根据生物制 品的用途、使用范围、使用方式、生产过 程和生产条件等因素来决定，设计时应注 意以下问题： – 安全性 – 免疫原性 – 遗传稳定性 – 生产适应性
1.安全性
①残余毒力
好 – 残余毒力高：免疫原性：
五、减毒活疫苗研究面临的问题
2.安全性和免疫原性之间的协调——难题 • Ty21a口服伤寒减毒活疫苗
– 最成功的营养缺陷型突变 人结核菌H37Rv
营养缺陷型突变
亮氨酸缺陷株
残余毒力 指数过高
五、减毒活疫苗研究面临的问题
2.安全性和免疫原性之间的协调——难题 霍乱减毒活疫苗： • 基因缺失株CVD112：
① 二倍体细胞
② 传代细胞
③ 原代细胞
① 人二倍体细胞株
• 来源: 正常人胎肺或其他组织
– 需进行全面检定 – 建立的细胞株的审批：《新生物制品审批办法》
• 建株资料：
– 所用胎儿的胎龄和性别，终止妊娠的原因; – 胎儿父母的年龄、职业及健康状况，胎儿父及母系 三代应无明显遗传缺陷疾病历史; – 原始组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长情 况; – 细胞培养的方法、历史、生长特征和寿命的世代数; – 细胞的生长液成分。
解决办法：使用基因工程技术对其进
行改造或取而代之
3. 国内外使用的减毒活疫苗一览表
分类 病毒疫苗 名称
甲型肝炎减毒活疫苗 麻疹减毒活疫苗 腮腺炎减毒活疫苗 黄热减毒活疫苗 脊髓灰质炎减毒活疫苗 乙型脑炎活疫苗 风疹减毒活疫苗 水痘减毒活疫苗 登革热减毒活疫苗 流感减毒活疫苗 腺病毒减毒活疫苗 炭疽减毒活疫苗 布氏菌减毒活疫苗 卡介苗 伤寒减毒活疫苗 霍乱减毒活疫苗 鼠疫减毒活疫苗
连续传代：100代
第一代减毒变异株 12-1-7 PHK细胞 蚀斑克隆
性状不稳定
神经毒力返祖
原代狗肾细 胞(PDK)
传9代
SA14-14-2/ PHK 蚀斑克隆 PHK细胞 乳鼠体 内传代
病毒株SA14-5-3
减毒过度，免 疫原性不足
恢复一定的免 疫原性
2. 减毒的策略
传统方法： • 细胞传代 • 动物传代 • 蚀斑挑选 • 化学诱变 • 营养突变等
– 检定用培养基等
(2)菌种培养 不同细菌，要求不同： – 培养基 – 培养温度 – 培养时间 – 菌落形态、颜色等
严格按照《中国生物制品规程》
3. 细菌性减毒活疫苗制备技术要求
(3)原液制备
– 液体培养基：收集菌膜，经洗涤、离心、压干 等不同处理步骤后，加 适量保护液制成所需浓 度的原液。 – 固体培养基：将菌苔刮入保护液，或用保护液 洗下菌苔制备原液。
• 传代细胞系：
– 在规定代次内使 用，有效去除细 胞DNA，残余 DNA需达标;
2. 良好的免疫原性
• 能促使机体产生：
– 高效价的保护性抗体
– 黏膜免疫
– 细胞介导免疫 – 并具有良好的免疫持久性
3. 遗传稳定性
弱毒株的来源？
– 天然弱毒 – 采用物理、化学和生物学方法将毒力较强的菌毒株
诱变为弱毒株
• 脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗
– 有的在长期使用后又面临新的挑战
• 卡介苗
– 有的在我国使用时间不长，尚待积累功绩
• 水痘减毒活疫苗
2.传统减毒活疫苗的局限与不足
• 无法或很难用传统技术研制疫苗
– 不能培养或难以培养的病原体
– 有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体
• 保护效果差、副反应大或使用不方便
接种途径
皮下注射 皮下注射 皮下注射 皮下注射 口服 皮下注射 皮下注射 皮下注射 皮下注射 喷雾 肌内注射 皮上划痕 皮上划痕 皮内注射 口服 口服 皮上划痕
国内使用 十
十 十 十 十
国外使用
— 十 十 十 十 — 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十
细菌疫苗
十 十 十 — — — 十 十 十 — — 十
载体疫苗(vector vaccine)
• 病毒载体疫苗
– – – – 痘苗病毒 腺病毒 麻疹病毒 脊髓灰质炎病毒等 – – – – – – – – – –
成本低 适于群体免疫
• 细菌载体疫苗
产单核细胞李斯特菌 沙门菌 霍乱弧菌 志贺菌 卡介苗 小肠耶尔森菌 炭疽杆菌 戈登菌属 乳杆菌属 葡萄球菌属等
• 稳定、不易发生毒力返祖
四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
1. 基因缺失活疫苗(gene deleted live vaccine) • DNA病毒
– 去除毒力基因的腺病毒，可用作减毒活疫苗株 ，也可作为载体疫苗的病毒载体。
• RNA病毒
四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
2. 遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)
– 保护率：84% – 6名志愿者中：引起3人轻度腹泻
• CVD-103 HgR株：
– 对不同人群诱导 抗体应答悬殊 – 免疫原性不恒定
五、减毒活疫苗研究面临的问题
3. 载体疫苗研究中存在的问题
①载体微生物蛋白的过量表达，严重干扰欲表达抗
原诱导机体免疫应答; ②非复制型载体微生物（如禽痘病毒）的减弱或消 失，导致目的抗原表达量降低，影响疫苗免疫原 性; ③目的抗原微生物和载体微生物感染途径不一定相 同，而致使目的抗原不能经自然感染途径免疫， 从而影响免疫效果。
– 蚀斑较大的：毒力相对强 – 蚀斑小的：毒力较弱
• 其减毒性在人体中必须是稳定的 • 减毒与免疫原性之间的平衡
– 减毒适度：保证人体使用安全 – 良好免疫原性：足以诱生特异性免疫应答
例：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株
SA14 原代地鼠肾细胞(PHK)
减毒与免疫原 性达到平衡 SA14-14-2/ PDK
– 特异噬菌体应能完全裂解待检细菌，培养后应 无细菌生长。
③菌落、菌形检查: 应具有典型的菌落特征
– 涂片镜检：培养典型形态 – 特殊染色法：形态学鉴别
检定内容
④活菌数测定:
– 一定温度、时间培后，单位体积的活菌数必须 在规定范围内。
⑤浓度测定:
– 按《中国细菌浊度标准》测定浓度。
⑥毒力试验:
– 一定量的菌种培养物分别注射小白鼠或豚鼠， 要求：
• 甲型流感病毒、轮状病毒和汉坦病毒等减毒活 疫苗株。
四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
3. 载体疫苗(vector vaccine)
• 利用非致病微生物作为载体、递呈外源抗 原的一种减毒疫苗。 • 将外源抗原的基因插入到载体微生物基因 组中，用这种表达外源抗原的微生物作为 疫苗。
四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
2. 减毒活疫苗的特点
• 能引发机体感染、但不发生临床症状
• 其免疫原性足以能刺激机体的免疫系统、
产生针对该病原体的免疫反应
• 在以后暴露于该病原体时，能保护机体不 患病或减轻临床过程。
二、减毒活疫苗的使用和研究现状
1. 使用现状
– 有的已完成历史任务而退役
• 牛痘苗
– 有的已经并正在继续发挥其良好的防病作用
– 残余毒力低：免疫原性：差
大 临床反应：
临床反应：小
• 所选用的菌、毒种必须在减毒性能和免疫
原性之间达到平衡
1.安全性
②致癌性
• 菌、毒种及代谢 物质：
– 不应有致癌作用;
• 诱变及筛选菌/毒株：
– 不用致癌性的药物;
• 载体疫苗：
– 载体是无毒或减毒 的 – 外源基因插入时， 不应引起毒力的返 祖。
– 应验明其记录、历史、来源和生物学特性。
• 主种子批
– 从原始种子批传出、扩增后冻干或深低温保存的。
• 工作种子批
– 从主种子批制备，用于生产。
• 主种子批和工作种子批在规定代次内的生物学
特性应与原始种子批一致
3. 细菌性减毒活疫苗制备技术要求
(1)培养基的制备
பைடு நூலகம்– 菌种用培养基
– 疫苗生产用培养基
• 通过强、弱毒株共同感染细胞，二者之间 进行基因片段的交换，而获得的减毒活疫 苗。 特点：
很大的盲目性，致使筛选特定的遗传重组病毒比
较困难。
四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
2. 遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)
• 反向遗传技术的发展，可以对分节段的RNA 病毒进行定向重配，提高重配效率。 • 研究热点：
– 低温培养传代以产生冷适应株 – 在特定温度下选育温度敏感株
• 动物体内分段或连续传代
致细胞病变效应
1.病原体的培养
(cytopathogenic effect，CPE )