CD34免疫组化染色在高分化肝细胞癌中的诊断意义丁莉利，杨丞，陈建娜（海南医学院病理学教研室，海南海口 571199）【摘要】目的探讨CD34染色阳性的微血管分布在高分化肝细胞癌、肝硬化、肝局灶性结节状增生和正常肝组织中的诊断及鉴别诊断意义。
方法应用免疫组织化学方法（EnVision法）对27例高分化肝细胞癌及其癌旁肝硬化组织、10例肝局灶性结节状增生及其病灶旁肝组织行CD34抗体标记，分析CD34染色阳性的微血管在高分化肝细胞癌、肝硬化、肝局灶性结节状增生和正常肝组织中的分布。
结果CD34染色阳性的微血管在高分化肝细胞癌中分布弥漫而均匀，在肝局灶性结节状增生中呈“地图样”分布，肝硬化和正常肝组织的肝窦内皮细胞均CD34染色阴性；CD34染色阳性的微血管在高分化肝细胞癌中的分布范围与肝局灶性结节状增生、肝硬化结节、正常肝组织均有显著统计学差异（P＜0.01）。
结论CD34可作为鉴别高分化肝细胞癌与肝硬化结节及肝局灶性结节状增生的有用指标,但CD34染色阳性的微血管在高分化肝细胞癌和肝局灶性结节状增生中的分布有一定交叉性，因此在肝穿刺活检诊断时应审慎判读CD34染色结果。
【关键词】肝细胞癌；CD34；免疫组化高分化肝细胞癌（well differentiated hepatocellular carcinoma，w-HCC）的细胞核异型性和肝板增厚均可不明显，与肝硬化结节和肝局灶性结节状增生（focal nodular hyperplasia，FNH）难鉴别，仅观察HE染色组织易造成误诊。
研究发现HCC中可出现明确的不伴有胆管的血管样结构，即肝窦的毛细血管化[1、2]。
因此，我们应用免疫组织化学染色的方法对w-HCC及其癌旁肝硬化组织、FNH 和病灶旁肝组织行CD34抗体标记，分析CD34染色阳性的微血管在w-HCC、肝硬化、FNH和正常肝组织中的分布，并探讨其诊断和鉴别诊断意义。
1 材料与方法1.1 标本来源收集海南医学院第一附属医院病理科2013年1月-2016年12月手术切除且诊断明确的w-HCC标本27例，FNH 10例。
所有w-HCC标本在癌旁均观察到肝硬化病变；所有FNH标本的病灶旁肝组织均结构正常、未见肝硬化病变。
1.2 方法所有标本经4％中性缓冲甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，4mm厚切片，HE染色，光镜观察。
免疫组织化学染色采用EnVision法，抗原修复采用高压高温煮沸法，所用单克隆抗体CD34和显色试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司，操作步骤按说明书进行。
1.3 结果判定CD34染色定位于内皮细胞细胞质，阳性为出现均匀棕黄色颗粒。
染色结果按CD34染色阳性的微血管分布范围行半定量判读：≤25%为1+，26%～50%为2+，51%～75%为3+，＞75%为4+。
1.4 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件对数据进行处理。
等级资料采用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。
2结果2.1 CD34的表达模式在w-HCC中,癌细胞梁索间的内皮细胞CD34染色阳性，阳性标记的微血管呈短小的裂隙或狭长的分支状，管壁纤细，管腔狭窄，在癌组织中分布弥漫而均匀，但有5例w-HCC的CD34在边缘病灶组织中局灶表达缺失（图1）。
FNH纤维间质内血管内皮细胞和部分肝窦内皮细胞CD34染色阳性，阳性标记的肝窦内皮细胞从结节周边不同程度地向结节中央延伸，阳性标记的微血管在FNH组织中呈“地图样”分布（图2）。
癌旁肝硬化组织门管区以及纤维架桥内血管内皮细胞CD34染色阳性，肝硬化结节仅周边极少量肝窦内皮细胞CD34染色阳性、结节内肝窦内皮细胞CD34染色阴性，阳性标记的微血管在肝硬化组织中呈“星芒状”分布（图3）。
FNH病灶旁正常肝组织仅中央静脉和门管区内血管内皮细胞CD34染色阳性，肝窦内皮细胞CD34染色均阴性，（图4）。
2.2 CD34的表达范围 CD34染色阳性的微血管在w-HCC、FNH、肝硬化结节和正常肝组织中分布范围的半定量判读结果见表1。
CD34染色阳性的微血管在w-HCC 中的分布范围与FNH、肝硬化结节、正常肝组织均有显著统计学差异（P＜0.01）。
CD34染色阳性的微血管在FNH中的分布范围与肝硬化结节、正常肝组织也均有显著统计学差异（P＜0.01）。
表1 CD34染色阳性的微血管在不同组织中分布的半定量判读组织类型例数CD34染色阳性的微血管1+ 2+ 3+ 4+w-HCC 27 0 0 4 23 FNH 10 0 7 2 1肝硬化27 27 0 0 0正常肝组织10 10 0 0 03 讨论在HCC的诊断中，进展期HCC因细胞形态恶性明显而比较容易诊断，但大部分w-HCC的核异型性不明显，而在周边的肝硬化区域有时细胞核的异型性也比较明显，此外肝组织还能发生局灶性结节状增生，因此在诊断w-HCC时，必然要与这些肝内的结节状病变鉴别。
CD34是一种分子质量为110kDa的单链跨膜蛋白，属于A 型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，主要表达于造血干细胞、急性白血病细胞和血管内皮细胞，因此CD34是血管源性肿瘤的特异性标记物之一。
在实体肿瘤中，CD34 染色常用于通过对肿瘤微血管密度判断来分析肿瘤血管生成的研究。
正常肝组织肝窦内皮细胞CD34染色阴性，仅中央静脉和门管区内血管内皮细胞染色阳性。
研究发现HCC的血液由新形成的“非配对”动脉供给，在形成过程中会出现新生窦样毛细血管，这些血管免疫组化染色显示CD34阳性。
因此CD34在HCC组织中会出现特征性的微血管内皮染色，称其为“HCC型染色”[1、2、3]。
Nakamura等报道，肝窦毛细血管化过程开始于肝癌早期，随着肿瘤的进展，肝窦毛细血管化程度不断增强[4]。
研究也发现CD34在w-HCC内皮细胞中的阳性细胞比率高于低级别异型增生结节（LGDN）、高级别异型增生结节（HGDN）、肝硬化结节和FNH，且CD34表达在肝硬化结节、LGDN、HGDN、HCC组织内皮细胞中依次增强[5]。
这些研究结果提示，CD34分子可能通过促进新生血管形成来参与肝细胞癌变的形成过程，因此CD34表达在一定程度上反映HCC的发展过程。
根据我们的观察，正常肝组织和肝硬化组织除门管区和纤维架桥内小血管分支及中央静脉外，其余区域肝窦内皮细胞基本不表达CD34。
CD34染色阳性的微血管在w-HCC的分布范围多为75%-100%，在大部分w-HCC中分布弥漫而均匀，仅少量w-HCC出现局灶表达缺失、且表达缺失部位位于病灶边缘。
CD34染色阳性的微血管在FNH的分布范围多为25%-75%，表达区与缺失区交错呈“地图样”分布。
CD34染色阳性的微血管不但在w-HCC、FNH、肝硬化结节和正常肝组织中的分布模式不同，且在w-HCC中的分布也比FNH、肝硬化结节和正常肝组织范围大。
尽管CD34免疫组化染色并不直接显示HCC 细胞,但本研究结果提示CD34可作为鉴别w-HCC 与肝硬化结节及FNH的有用指标。
w-HCC多由肝硬化经异型增生结节发展而来，在w-HCC的周边常存在残留的异型增生灶。
在病理诊断时，病理医生难以在同一病灶内明确区分w-HCC组织和异型增生组织，因而w-HCC的病灶边缘组织中内皮细胞CD34表达缺失提示w-HCC 残留异型增生灶。
FNH被认为是继发于局部血管异常的肝细胞再生性增生反应，肝窦血供的动脉化或血流量增大导致肝细胞结节性增生[6]。
有研究报导在FNH中可见肝窦内皮细胞CD34阳性表达，表明FNH也存在肝窦内皮细胞的毛细血管化，且CD34标记的微血管在增生结节边缘呈高密度，越到结节中央密度越低 [7、8]，本研究也观察到CD34染色阳性的微血管在FNH中的分布范围比肝硬化结节和正常肝组织大，且在w-HCC和FNH中的分布也有一定交叉性。
随着超声引导下穿刺技术的应用日益广泛，肝穿刺活检标本越来越多。
穿刺标本组织量少、观察局限，无法准确判断CD34在病变组织中的表达模式和表达范围，因此病理医师在对肝穿刺标本行病理诊断时，特别是在鉴别w-HCC和FNH时，应审慎判读CD34染色结果，以提高诊断的准确性。
图1 高分化肝细胞癌(x40) CD34阳性标记的微血管分布弥漫而均匀，右侧表达缺失图2 肝局灶性结节状增生(x40) CD34阳性标记的微血管呈“地图样”分布图3 肝硬化(x40) 门管区及纤维架桥内血管内皮细胞CD34染色阳性图4 正常肝组织(x40) 中央静脉和门管区内血管内皮细胞CD34染色阳性参考文献[1] 周晓军，姜锦贵，孙桂勤，等．CD34在肝细胞癌血窦中的表达．中华病理学杂志[J]，1998，27(3)：225-226．[2] Ohmori S，Shiraki K，Sugimoto K．et a1．High expression of CD34- positive sinusoidal endothelial cells is risk factor for hepatocellular carcinoma in patients with HCV-associated chronic liver diseases．Hum Pathol[J]. 2001, 32(12)：1363-1370．[3] 李桂梅，侯宁，杨志慧，等．glypican-3、HepParl和CD34在肝细胞癌中的表达及临床意义. 诊断病理学杂志[J]，2015，22（2）：95-98.[4] Nakamura K，Zen Y，Sato Y，et a1．Vascular endothelial growth factor，its receptor Flk—l，and hypoxia inducible factor—lalpha are involved in malignant transformation in dysplastatic nodules of the liver[J]．Hum Pathol，2007，38(10)：1532-1546．[5] 杜经丽，韦立新，王玉兰．磷脂酰肌醇蛋白聚糖3等抗体在高分化肝细胞肝癌中的表达及其鉴别诊断意义[J]．中华病理学杂志，2011，40(1)：11-16．[6] Wanless IR，Mawdsley C，Admas R．On the pathogenesis of focal nodular hyperplasia of the liver[J]．Hepatology，1985，5(6)：1194-1200．[7] 管小琴，米粲，李圃圆. 5例肝局灶性结节性增生的临床病理学观察. 诊断病理学杂志[J]，2000，7（4）：252-254.[8] 平金良，茅建忠，徐炜，等．肝局灶性结节性增生的鉴别诊断.肿瘤研究与临床[J]，2008，20（2）：97-98.通讯作者：丁莉利。