2008年度新苗人才计划项目项目名称：壳寡糖的酶法制备和分离技术的研究一、立项背景及意义壳寡糖(Chitooligosaccharide)，又名甲壳低聚糖，是由氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的聚合度约为2-20的低聚糖，其分子量低于5000，具有稳定的三维结构。

壳寡糖可运用壳聚糖经过生物酶技术降解制得。

壳聚糖广泛存在于自然界的虾壳、蟹壳和真菌中，虽然有特殊的生物活性，但由于其分子量大、水溶性差，在人体不易被吸收而使其应用受到限制。

作为一种生物技术产品，壳寡糖几乎包括了所有壳聚糖的所有优点，它具有良好的生物相容性和生物降解性、亲水性、吸附性、生物学活性等多种理化特征以及天然、高效、毒副作用少、抗药性不显著、性能多样等特点。

科学研究表明，壳寡糖的功能作用和生物活性比起壳聚糖将提高数十倍、应用领域更加广泛、人体吸收率近100%（壳聚糖吸收率6.48%），而且增加了促进钙吸收的新的功能作用，具有较高的科技含量和附加值，发达国家称其为“软黄金”。

壳寡糖具有三调（免疫调节、调节pH值、调节荷尔蒙）、三降（降血脂、降血糖、降血压）、三排（排胆固醇、排重金属离子、排毒素）、三抑（抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素）等功能，同时，还具有抗自由基、防辐射、抗炎、止血以及促进伤口愈合等功能。

壳寡糖及其衍生产品可广泛应用于医药、保健、食品、日化、农业等领域。

在医药保健领域具有提高免疫、活化细胞、调节血糖血脂血压胆固醇、预防治疗癌症、强化肝功、促进钙吸收、增殖肠道有益菌等功能；在食品饮料领域是一种良好的健康食品添加剂，可增殖乳酸菌、双歧杆菌等人体有益菌100倍以上；在日化领域具有营养皮肤、抑菌、保湿等功能，性能优于传统的透明质酸等产品；在农业领域可激活植物免疫系统和酶系活性，能促进植物生长、提高作物产量和品质、增强抗病力、增殖生物菌肥有益菌群等，具有药肥双效功能，被誉为“不是农药的农药，不是化肥的化肥”，市场前景极其广阔。

目前壳寡糖产品的年需求量在6000吨以上。

在精细化工领域，由于壳寡糖的绿色天然的特性符合世界日化产品的发展趋势，含天然活性物质的化妆品顺应回归自然、科学美容的消费趋势，欧洲现已有60多个与壳寡糖相关的化妆品品牌，年需求壳寡糖1500吨。

我国化妆品年销售额从1982年的2亿元人民币发展到2001年的400亿元，居亚洲第二位。

在生物医药领域，从中国产业发展研究中心统计可知， 2005年我国医药生物技术工业总产值将达到400亿-500亿元。

在保健食品领域，韩国于1996年即批准壳寡糖为功能性保健食品，我国现在已有许多保健品及药品等年需求壳寡糖上百吨的保健食品生产厂家，国许多医药保健品公司正在申报壳寡糖保健食品文号，预计年需求量将以高于30%的速度递增。

在农林畜牧领域，因壳寡糖具有良好的抗病虫害功能,且有安全、微量、高效、成本低等优势，可使水果、蔬菜、粮食增产10%-30%，因而可以应用于生物农药产品，部分替代化学农药。

目前我国农业病虫害共2000余种，受灾面积数10亿亩。

因此壳寡糖在农林畜牧上的应用对我国的农业可持续发展具有重要意义，以壳寡糖为基础的生物农药将有广阔的发展空间。

科技部已将“壳寡糖新产品的开发应用”列为国家“九五”攻关计划项目和“十五”招投标项目，要求建立数条年产500吨以上的壳寡糖生产线，到2015年总产值可达1100亿-1300亿元，从而满足国市场的需求。

壳寡糖的级别不同，售价差额较大。

农业专用壳寡糖市场价为400元/公斤；食品级壳寡糖市场价为600元/公斤；而化妆品级壳寡糖市场价为150元/公斤。

随着壳寡糖应用围的不断扩大，加之作为一种性能优异的基础原料，市场需求量将呈稳步上升趋势。

同时，壳寡糖作为一种中间原料，出口市场稳定。

近年来，随着我省海产品加工业的发展，尤其是甲壳素综合利用产业的兴起，我省逐步成为东南亚地区海产品加工利用中心和主要的甲壳素产业发展基地。

2001年全省甲壳素制品的直接经济总产值约10亿元左右（与其相关的、间接的纺织、食品、医药、化工等行业的产值达数百亿元）。

在此基础上，本项目从壳聚糖的局限性出发，着重研究了通过专一性酶法技术降解壳聚糖，制备聚合度均一的壳寡糖产品，将使产品的附加值得到大幅度地提升。

因此，本项目的实施，对于有效利用甲壳素资源，促进我省甲壳素行业健康发展，意义重大。

由于项目原料来源方便、价格低廉，将大大降低了加工企业的生产成本，满足了市场紧缺，且安全无公害，推广应用前景广阔，对全国的水产加工业发展具有重要影响。

二、国外研究现状与发展趋势开发应用壳寡糖是甲壳质行业的制高点，也是当今生物制药技术的一个亮点。

目前，其科研开发主要集中在日本、韩国等国家。

壳寡糖的主要制备方法有化学法、物理法和生物法。

化学法主要包括酸水解法、氧化法、超临界流体法、配位降解法等。

目前，国对H2O2氧化降解法研究较多，可在降解过程中伴随的副反应还需要探索出有效的遏止方法，另外必须注意氧化降解对产品活性的影响以及存在残留的H2O2对食品安全性是否产生隐患也是值得考虑。

物理法包括微波法、超声波法、光降解法、γ射线法等。

生物法主要有酶法降解、反应器和酶降解、糖基转移法等。

其中已用于工业化生产的有酸水解法、氧化降解法, 但是存在产品相对分子质量分布较宽, 均一性差，分离纯化难度高以及污染严重等问题；物理方法也有一定的缺点, 不能作为主体方法用于壳寡糖的制备；酶降解法条件温和, 产物不用脱盐，工艺易于控制, 易于得到所需聚合度的壳寡糖, 并且对环境不产生污染，是较理想的制备方法，特别是酶降解和反应器联合方法, 已经在产业化道路上迈出第一步，但在制备工艺上还有许多有待改进提高产量的地方。

20世纪90年代末，酶法生产壳寡糖在日本、韩国实现了产业化。

我国对该产品的研究虽起步较晚，但近年来做了大量的工作，并趋于活跃。

2002年8月，山力、海得贝公司利用复合酶法制备壳寡糖的生产线正式投产，壳寡糖在我国第一次实现了产业化生产。

复合酶比起专一性酶制备壳寡糖，所得降解产物相对分子量分布不容易控制，聚合度不够均一。

但因为目前市场上专一性酶价格昂贵，如何寻找到降解效果好、成本又不高的专一性酶，是一个急需解决的技术难题。

而这一技术难题的解决无疑将为我国整个甲壳素行业的发展提供帮助。

三、项目主要研究开发容、技术关键以及科研创新的主要方式（一）主要研究容：1、专一性酶菌种的筛选。

通过制作以壳聚糖为唯一碳源的平板筛选分离培养基进行筛选。

采用平板划线分离法接种，放入30℃培养箱培养3-4天。

之后，观察培养基，取有透明圈的平板，挑选菌种，进一步进行发酵培养，测定酶活。

2、产酶菌种的发酵培养。

根据已优化的发酵培养条件进行发酵培养，对发酵上清液中粗酶，采用75%饱和度乙醇沉淀，获得粗酶粉，测定酶活力，低温保存。

3、壳寡糖的酶法制备和性质研究通过还原端基、酶解产物聚合度、水解液调碱性后透光率变化测定以及酶解产物的TLC、 HPLC分析，研究壳聚糖酶降解壳聚糖过程中壳聚糖脱乙酰化度、壳聚糖浓度、酶用量、反应时间和pH值对酶促反应速率和产物聚合度的影响。

4、研究壳寡糖的分离技术、纯化工艺；超滤/离子交换树脂5、壳寡糖的含量检测方法研究；采用高效液相色谱法(HPLC)、测定低聚糖类的含量。

6、壳寡糖产品质量标准的制定。

（二）关键技术：1、高活力壳聚糖酶制剂的制备以及壳聚糖酶酶活的测定；2、壳寡糖的酶法制备技术；3、壳寡糖的分离技术；4、壳寡糖制品分析检验技术，包括还原端基、酶解产物聚合度、水解液调碱性后透光率变化的测定；壳寡糖的含量和纯度、相对分子质量、杂质含量的测定；壳寡糖水溶性、水分的测定以及酶解产物的TLC 、HPLC分析。

（三）创新的主要方式：1、壳寡糖产品加工采用酶法工艺，克服了传统化学法分子量分布围宽、易变色的缺点，且不会带来环境污染问题2、为壳聚糖的高值化利用提供了新途径。

四、项目预期目标（一）主要技术经济指标1、目标：（1）以壳聚糖为原料，采用酶法的技术有效地制备、分离壳寡糖；（2）提供完整的加工技术研究报告，包括提取工艺、分离技术、产品质量研究、操作技术流程等。

2、壳寡糖产品技术指标（1）水分含量<7% （105℃）；（2）分子量为500-5000Da （Waters 600E检测）；（3）不溶物≤1.0％；（4）粘度（5％）≤10 mPaS；（5）pH 4-6 ；（6）脱乙酰度≥70％；（7）六、七、八糖含量达到50%以上；（8）分散度小于1.5；3、经济指标（1）发表相关学术论文1篇；（2）提供符合质量标准的样品。

（二）应用或产业化前景壳寡糖在食品加工中可用壳寡糖做填充剂、增色剂、脱色剂、稳定剂和保鲜包状膜。

壳寡糖的应用围在不断扩大，受到了国家的高度重视。

目前市场上壳寡糖价格比较高，一直处于求大于供的现象。

如何有效地解决这一问题，就需要研究和探索可行的方法来制备壳寡糖。

酶法生产壳寡糖项目，将有利促进了我国壳寡糖行业的发展。

与其它降解法相比，酶降解法具有反应条件温和，降解过程及降解产物相对分子量分布容易控制，制备的低聚糖生物活性高，产物不用除盐。

过程容易控制，且不对环境造成污染等优势，是理想的壳寡糖生产方法。

本项目的制备方法解决了产品的安全性问题，减少资源浪费，满足市场要求，应用前景广阔。

但低聚壳聚糖的制备，尤其是聚合度6-8壳寡糖的制备大都处于实验室的研究阶段。

因此，本项目拟在实验室研究的基础上，通过专一性酶法制备壳寡糖，进一步发展成产业化，以满足国外对壳寡糖的需求。

五、项目实施方案（一）技术路线1、采用专一性酶解法进行制备壳寡糖；2、壳寡糖的分离，纯化精制技术研究采用水解产物薄层层析(TLC)分析、水解产物(HPLC)分析。

3、提取率及品质分析采用数理统计的方法来分析提取率的高低，此外，采用相应的方法进行质量、水溶性、水分的检测。

4、技术流程（二）组织方式以组员分工合作的形式来负责完成此项课题（三）课题分解（1）菌种的筛选；（2）产酶菌种的发酵培养；（3）壳寡糖的酶法制备和性质研究；六、计划进度安排七、现有工作基础与条件实验室具备实验所需的设备：TGL-16C台式离心机上海安亭科学仪器厂电热恒温水浴锅金坛县国华仪器厂XW-80A漩涡混合器上海医科大学仪器厂隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械仪器一厂HYG-A型回转恒温调速摇瓶柜太仓市实验设备厂手提式灭菌锅市第二医疗器械厂超净台净化设备厂磁力搅拌器江阴科研器械厂WFZ-W2100紫外/可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司W1100紫外分光光度计北京瑞利分析仪器公司Mettler Toledo 320-5 pH计上海梅特勒乌氏粘度计八、经费预算省级科技计划项目经费预算表项目名称：金额单位：万元。