生鲜牛乳中氟喹诺酮类药物残留的检测方法张均媚1吴晓明2刘伟娟1李卓1薛刚1张燕1马文红1（1.天津市乳品食品检测中心，天津300381；2.天津理工大学材料科学与工程学院，天津300384）摘要：本方法在生鲜牛乳中莱克多巴胺的检测限为2μｇ/kg，本方法在2ppb～100ppb添加浓度水平上回收率为60%～120%，本方法与仪器技术分析相比具有操作简便，快速，准确度和灵敏度高，样品加标率回收效果好，检出限低，试剂盒稳定性好，重现性好等特点。
关键词：生鲜牛乳；氟喹诺酮类药物；残留量；酶标仪Determination Method of Fluroquinolones Residues in Fresh MilkZHANG Jun-mei 1 WU Xiao-ming 2 LIU Wei-juan 1 LI Zhuo 1 XUE Gang 1 ZHANG Yan 1MAWen-hong1(1. Tianjin Monitoring Center for Milk Products and Food, Tianjin 300381, China;2. School of Materials Science & Engineering, Tianjin University of Technology,Tianjin 300384, China )Abstract:The method in fresh milk ractopamine detection limit of 2 μg / kg, this method 2ppb ~ 100ppb level of recovery of the added concentration of 60% to 120% of this method compared with the instrumentation is simple, fast accuracy and high sensitivity, rate of recovery of spiked effective, low detection limit kit, good stability, reproducibility is good.Keywords: Fresh milk, Fluroquinolones, Residues, ELISA reader氟喹诺酮类(fluoroquinolones，FQNS或FQS)药物属第3代喹诺酮类抗菌药，因其在喹诺酮萘啶环的6位处引入了氟原子，7位上都连有哌嗪环，所以统称氟喹诺酮类，是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物。
该类药物抗菌谱广、抗菌活性强，抗菌活性好，对葡萄球菌、肺炎球菌、某些厌氧菌和支原体等均有效，特别是对绿脓杆菌效果很好，几乎适用于奶牛临床常见的各种细菌感染性疾病。
但由于药物本身特性及不合理用药和滥用药物现象的存在，引起了一系列的不良反应，人体累计摄入量超过一定值或食用了高残留的含有氟喹诺酮类药物的食物后可能会出现中毒症状，常见的有皮肤过敏及光敏反应、中枢神经系统反应、循环系统反应、消化系统反应、泌尿系统反应、呼吸系统反应、软骨毒性、肝脏毒性、生殖毒性、跟腱炎和局部刺激症状等。
1 材料和方法1.1仪器与试剂以下所用的试剂，除特别注明外均为析纯试剂，水为符合GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法，规定的二级水。
1.1.1 乙腈，优级纯试剂，天津市光复科技发展有限公司；正己烷，优级纯试剂，天津市光复科技发展有限公司；二氯甲烷，优级纯试剂，天津市光复科技发展有限公司；氢氧化钠，优级纯试剂，天津市光复科技发展有限公司；十二水合磷酸氢二钠，优级纯试剂，天津市光复科技发展有限公司；二水合磷酸氢二钠，优级纯试剂，天津市光复科技发展有限公司。
1.1.2 氟喹诺酮快速检测试剂盒（2℃～8℃冰箱中保存），北京望尔生物技术有限公司。
1.1.2.1 氟喹诺酮类系列标准溶液0μｇ/ｇ、1.0μｇ/ｇ、3.0μｇ/ｇ、9.0μｇ/ｇ、27μｇ/g、81μｇ/ｇ1.1.2.2 包被有氟喹诺酮类药物偶联抗原的96孔板12条×8孔。
1.1.2.3 氟喹诺酮类药物抗体工作液1.1.2.4 酶标记物工作液1.1.2.5 底物液A液1.1.2.6 底物液B液1.1.2.7终止液1.1.2.82倍浓缩缓冲液1.1.2.9 20倍浓缩洗涤液1.1.3 缓冲液工作液用水将2倍浓缩缓冲液按1:1体积比进行稀释（1份2倍浓缩缓冲液+1份灭菌水），用于溶解干燥的残留物。
4℃保存，有效期1个月。
1.1.4 洗涤工作液用水将20倍浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释（1份20倍浓缩洗涤液+19份灭菌水），用于酶标板的洗涤。
4℃保存，有效期1个月。
1.1.50.1mol/L氢氧化钠溶液称取0.4g氢氧化钠加水溶解稀释至100mL。
1.1.6乙腈-0.1mol/L氢氧化钠溶液（50:10,v/v）取乙腈50mL，0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL混合均匀。
1.1.7磷酸盐缓冲液（0.02mol/L，pH7.2）称取5.16g十二水合磷酸氢二钠和0.87g二水合磷酸二氢钠加水溶解稀释至1L。
1.2 仪器1.2.1酶标仪配备450nm滤光片RT-6000, 深圳霖杜生命科学股份有限公司；1.2.2氮吹仪M32 上海大普仪器有限公司；1.2.3振荡器E11 天津市三水科学仪器有限公司；1.2.4涡旋仪X 55 北京星海有限公司；1.2.5离心机L31 上海医用仪器厂；1.2.6电子天平：感量0.001g，AB204德国赛多利斯公司；1.2.7微量移液器：单道200μL、1000μL，多道100μL北京吉尔森有限公司。
2测定步骤2.1样品制备：取500g生鲜牛乳试样混匀备用，称取5g±0.001g备用试样于50mL离心管中，加乙腈—0.1mol/L氢氧化钠溶液（50:10,v/v）12mL，震荡5min，4000r/min离心5min；取上清液6mL，加0.02mol/L磷酸盐缓冲液6mL，再加二氯甲烷7mL，震荡5min，4000r/min离心5min；取下层有机相6mL于10mL离心管中，于50℃下氮气吹干；加0.02mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL，涡旋震动2min，加正己烷1mL，涡旋震动30s，4000r/min离心5min；取下层清液50μL进行分析。
本方法稀释倍数为0.5倍。
2.2测定2.2.1 测定前将试剂盒在室温（19℃～25℃）下放置1h ～2h ，使所有试剂和所需要板条的温度回升至室温（19℃～25℃）。
使用之后立即将所用试剂和未用的板条放回2℃～8℃冷藏保存。
2.2.2 按每个标准溶液和试样溶液至少两个平行，计算所需酶标板条的数量，插入板架。
2.2.3 使用前将每种溶液混匀。
2.2.4加系列标准溶液和试样（2.1）50μL 到相对应的微孔中，每孔加入酶标记物工作液50μL ，再在每孔中加入氟喹诺酮类药物抗体工作液50μL ，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温下避光反应60min 。
倒出孔中的液体，将孔内液体甩干，再将酶标板倒置于吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，加入250μＬ洗涤工作液置于每个孔中，轻轻震荡5s 后到掉孔中液体再将酶标板倒置于吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体。
再加入250μＬ洗涤工作液于每个孔中重复以上操作，以保证充分洗涤4～5次，每次间隔10s ，最后用吸水纸拍干，如有洗板机可用洗板机洗涤（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头扎破）。
2.2.5 每孔中加入底物液A 液50μL 和底物液B 液50μL ，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温下避光反应40min 。
2.2.6 最后每孔加入终止液50μＬ，轻轻振荡酶标板混匀，置酶标仪于450nm 波长处测量吸光度值。
3结果计算用所获得的标准溶液和试样液吸光度值的比值进行计算。
见公式（1）： %100%0⨯=B B ）相对吸光度值（ ———————（1）公式中： B ------- 标准（试样）溶液的吸光度值；B 0 ------- 空白（浓度为0标准溶液）的吸光度值。
将计算的相对吸光度值（%）对应氟喹诺酮类药物标准品浓度（μｇ/L ）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出（见图1）。
图 14 结果与分析4.1灵敏度本方法在生鲜牛乳中莱克多巴胺的检测限为2μｇ/kg。
4.2准确度本方法在2ppb～100ppb添加浓度水平上回收率为60%～120%。
4.3精密度本方法的批内试剂盒变异系数为≤30%，批间变异系数≤40%。
4.4本方法与仪器技术分析相比具有操作简便，快速，准确度和灵敏度高，样品加标率回收效果好，检出限低，试剂盒稳定性好，重现性好等特点，操作时间仅需２个小时，能最大限度地减少工作强度和操作误差。
参考文献：[1] 李剑勇．动物用氟喹诺酮类药物的研究进展概况[Ｊ]中兽医医药杂志，2004（6）：19-23[2] 郭海燕．氟喹诺酮类药物在水产动物体内的药动学和残留规律[Ｊ]，水生态学杂志，2008（5）：34-41[3] 动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测酶联免疫吸附法．[S]农业部1025号公告—8—2008，1-4.[4] 杜黎明. 反相高效液相色谱法同时测定6种氟喹诺酮类药物[Ｊ]．色谱2003（5）:58-61[5] 杨长志.物源性食品中五种氟喹诺酮类药物残留量的同时测定[Ｊ].分析实验室,2008(9):82-85[6] 杜黎明.效液相色谱法测定氟喹诺酮类药物[Ｊ].分析化学 , 2003（5）：637-638[7] 汪雪雁.氟喹诺酮类药物残留分析研究进展[Ｊ].安徽农业科学,2004(5):1021-1023作者简介：张均媚：1977年12月4日；大学本科学历；女；民族，汉；职称，工程师；研究方向，食品安全与质量控制。