题目：一种快速鉴定雉科鸟类的性别的方法作者苏浩宇完成日期2012年10月指导老师：彭确昆摘要：在参观成都市观鸟月的活动中，我发现动物园中很多雉科鸟类的颜色十分鲜艳且很相近，很难用肉眼进行辨别它们的性别，比如雉鹑、鹌鹑等。
尤其是这些鸟类在野外要对他们进行性别辨别将是一件很困难的事情。
通过文献查阅，我清楚地了解到雉科鸟类中有很大一部分的动物，它们的雌雄个体的体态相似，羽毛颜色很接近，它们并不像我们在公园里见到的孔雀和家鸡一样很容易通过颜色和体态就可以进行性别区分，这一类鸟叫单形态鸟。
这一个问题引起了我极大的兴趣，如果不能很好的区分这些鸟的性别对于我们的保护人员来说就不能很好的开展繁育保护工作。
因此这一问题值得我们去探究。
高中教科书中介绍了关于鸟类性别的很多知识。
我们知道鸟类的性别决定系统为ZW型(其中雄性为ZZ, 雌性为ZW),。
在鸟类性别鉴定的历史中，曾经也出现过很多的技术，但是由于这些基因或者方法不够稳定，因此逐渐被人们舍弃。
后来，人们就将目光转移到决定鸟类性别的ZW染色体上，并找到了这样一个可以很好区分雌雄个体的基因-CHD基因。
CHD基因在鸟类中有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，雄雄鸟中只有CHD-Z，而雌性鸟类中同时具有CHD-W和CHD-Z，且CHD-Z基因的长度要小于CHD-W。
因此，利用一对CHD基因引物同时去扩增鸟类的CHD基因，那么在雄性鸟类中只会得到一个大小长度的基因片段，而在雌鸟中由于具有两个不同长度的拷贝，再通过电泳将不同长度的CHD 基因区分开，这样就可以直观的观察到二者的差异。
本实验我们根据已有的CHD基因序列重新设计了一对CHD基因内含子的引物对，这一对引物序列更短，扩增效果更好。
我们利用该引物对来自成都市动物园的四组(8个)雉科个体的CHD基因进行了扩增，电泳检测结果显示雄性CHD基因的长度和雌性存在差异，雌雄具有两条带大小不一的带型，而雄性只有一条带。
这一方法能准确无误地区分雉科鸟类的性别，同时也说明CHD基因作为雉科鸟类性别鉴定的分子标记是可靠的。
这一实验虽然简单，但是可以帮我们的鸟类保护者很好对这些濒危的鸟类进行繁育和保护，有着非常重要的意义。
关键词：雉科，CHD基因，性别鉴定，PCR1引言去年夏天，我参加了学校组织的观鸟爱鸟月活动，和来自成都高校的几位老师和同学一起进行了为期一个月的成都市鸟类观察活动。
整个活动内容非常丰富，不仅让我对鸟类有更多更新的认识，还激励了我将来积极投身于鸟类的保护行动中去。
在参观成都市动物园的过程中，我看到了很多非常美丽的鸟类，它们长着美丽的长羽毛，飞行能力不是很好，常常成双成对结伴觅食，最后我询问一道参观的老师，才得知这些美丽的鸟儿都是属于雉科的鸟类。
对于一个高中生来说，“雉科”这个陌生的名字让我对它们的身世产生了浓厚的兴趣，此外，这些走起路来器宇轩昂的鸟儿似乎在向我们宣示“双鸟傍地走，安能便是我雌雄？”这些长相酷似的鸟儿到底谁是雄性谁是雌性呢？带着这些疑问，我决定去借助电子图书馆一查究竟。
随后，我登录到四川大学电子图书馆利用这里丰富的电子资源查到了很多关于雉科鸟儿的知识，并着手找到一种能快速准确鉴定这些鸟儿性别的方法。
通过查阅文献，我得知生物学家按照亲缘关系的远近，将生物分为界、门、纲、目、科、属、种这些不同的类，雉科其实是鸟类下面的一级分类单元。
雉科在生物分类学上是鸟纲中的鸡形目中的一个科，多达26属166个物种。
我国是世界上雉科鸟类最多的国家，拥有90%的雉科鸟类物种。
在中国，特别是中国的西南地区种类非常丰富，拥有世界上雉科近1/3的种类，其中又有大约1/3是我国的特产种，有“雉类的王国”之称。
中国的雉科中有超过一半的种类是国家重点保护野生动物。
雉科又有分为雉类和鹑类，雉类通常颜色较为鲜艳，且雌雄个体的颜色差异很大，通常是雄性的颜色较为鲜艳，而雌雄的颜色则较为暗淡。
雉类中的鸟最为常见的有家鸡，孔雀等，它们雌雄个体的颜色通常可以通过肉眼就可以辨别。
而鹑类中的很多鸟儿，比如鹌鹑、鹧鸪（图1-1）等，它们雌雄个体羽毛的颜色都较为暗淡，差异很小，很难通过肉眼的方法鉴别它们的性别。
此外，有一些雉科鸟类的成鸟的性别很容易判定, 比如可以通过羽毛的颜色或个体大小来区分。
但是对于幼鸟, 作为性别标记的成年鸟类羽色特征还未出现, 因此如果保育员或者研究者们要对它们进行标记进行人工性别选择等就会带来很大困难[1]。
同样, 性别问题也给从事鸟类研究的科研人员带来了麻烦, 在对鸟类性别划分理论以及鸟类进化理论等的研究中,由于雌雄个体在行为和生理上是有差别的, 性别不能准确判定, 就会得出错误的研究结论。
无论是为了人工繁育、保存物种还是科研,尤其是随着一些野生珍稀鸟类的不断灭绝, 鸟类的性别鉴定技术的研究和建立都迫在眉睫。
因此，为方便动物园的工作人员以后在雉科鸟类育种的时候进行有效的鉴定和筛选，为我们的雉科鸟类繁育和保护贡献自己的一点微薄之力，我决定借助于现在生物学的知识找到一种快速有效的鉴定方法。
在四川大学的电子图书馆，我下载了很多关于雉科鸟类的文章，我发现其实关于鸟类性别鉴定的方法在上个世界90年代才陆续出现，这些方法鉴定地主要对象是平胸目鸟类，比如鸵鸟、白鹳等这些动物，而专门针对雉科鸟类性别坚定地方法并没有。
在鸟类性别鉴定的分子手段出现之前，外科手术，染色体等常作为单形态鸟类的性别鉴定的手段。
但是这些手段常常由于对观察对象要求高以及耗时耗力等因素，已经逐渐被淘汰。
比如，鸟类生殖器官通常位于体内，要想区别它们性器官必须要捕获它们才能进行细致的鉴别，因此很多时候一些鸟类，尤其是野生鸟类常会受到惊吓，从而影响它们的生活习性，甚至繁育，对鸟儿来说是一种伤害性的手段。
此外，比如我们知道雌雄鸟类的性染色体的形态也有差别，我们可以将鸟儿的细胞染色体进行区分，找到性染色体的差异也可以鉴定性别，但是这种方法需要我们从鸟的身上采集细胞，然后培养制作染色体标本，并在显微镜下进行观察。
很显然，这种方法耗时耗力，且会给鸟的身体造成伤害，不能最活体鸟类进行。
中学生物教科书中有专门介绍鸟类的性别的内容。
鸟类的性别决定型和哺乳动物人是不一样的，鸟类的性别决定是ZW型, 性染色体有Z和W两种，雄性为ZZ, 雌性为ZW。
因此，鸟类的性别差异就存在于性染色体上，性染色体上的基因就是我们去区分性别的出发点。
在上个世纪，一些科学家在鸟类的性染色体上发现了一个在雌雄鸟类中有差异的基因，那就是CHD基因。
CHD基因实际上是一个在染色质转变成染色体过程中起作用的一个蛋白质编码基因，它可以帮助细胞在分裂末期将染色质包装成染色体。
CHD基因在鸟类中有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，雄雄鸟中只有CHD-Z，而雌性鸟类中同时具有CHD-W和CHD-Z，且CHD-Z基因的长度要小于CHD-W。
因此，利用一对CHD基因引物同时去扩增鸟类的CHD基因，那么在雄性鸟类中只会得到一个大小长度的基因片段，而在雌鸟中由于具有两个不同长度的拷贝，再通过电泳将不同长度的CHD 基因区分开，这样就可以直观的观察到二者的差异。
Griffiths等人在1996[3]设计了一对P2( 5‘-TCT GCA TCG CTA AAT CCT TT-3’) 和P3 ( 5‘-AGA TAT TCC GGA TCT GAT AGT GA-3’) 引物对扩增了CHD-W和CHD-Z的部分片段, 结果显示扩增产物大小是相同的,但他们发现CHD-W扩增片断有一个Hae酶切位点,而CHD-Z却没有, 于是, 在PCR之后先用Hae处理，这样雄性仍为一条带，而雌性为45bp和65bp两条带，而且成功地对珍稀鸟类金刚鹦鹉[4]进行了性别鉴定。
四川大学的周鑫等[5]曾报导过利用CHD基因对四川雉鹑的性别鉴定，他们利用通用引物2550F/2718R扩增四川雉鹑基因组CHD基因，其中雄性个体扩增出约500bp的条带，而雌性个体扩增出500bp和750bp两条条带，从而可以鉴别出四川雉鹑的性别。
然而，该研究仅探索了有限数量种群——四川雉鹑的性别鉴定方法，且扩增出的片段较长，带型不够稳定，尤其是雌性的两条带通产不能很好的同时显示，不适合于DNA样品质量较差时的情况，如通过非损伤性取样所获得的DNA。
本研究我在之前的研究基础上，我从NCBI基因库中找到了CHD基因的序列，并通过软件参考前人设计的引物在CHD基因的中设计了一对扩增片段更为短的引物，这一对引物横跨了雌雄雉科鸟类CHD基因变异区的位置，不用经过酶切直接通过电泳就可以区分开片段的大小。
且片段的长度只有390bp左右，片段的扩增效果更好，结果稳定。
在10个小时之内可以快速准确的鉴定出雉科鸟类的性别。
这一方法也为动物园以及野外雉科鸟类保护工作者们提供了很好的便利，方便它们对雉科鸟类繁育和保护工作的开展。
2材料和方法2.1 材料本实验所用的8个雉科鸟的血液样本取自成都市动物园，并加入了ACD抗凝剂。
剩余新鲜血液保存于液氮中。
4种雉科鸟分别是白冠长尾雉（1♂，1♀），红腹锦鸡（1♂，1♀），勺鸡（1♂，1♀）和白马鸡（1♂，1♀）。
2.2 方法2.2.1 血液基因组DNA的提取(1)取约30μl鸡血液样品，放入1.5ml的离心管中；(2) 加入500μL裂解缓冲液(10mmol/L Tris-Cl；0.1mol/L EDTA；0.5% SDS；pH 8.0)，加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml，混合均匀；(3)55 o C水浴过夜，同时慢速振荡，直到消化液变清亮为止；(4)加入与消化液等体积的饱和酚，缓慢颠倒10min直至两相混合成乳浊液，室温13,200rpm离心10min，用小枪头缓慢将黏滞的上清液移至另一离心管；(5)加上清等体积的苯酚/氯仿异戊醇(25:24:1)，缓慢颠倒10min直至两相混合成乳浊液，室温13,200rpm离心10min，转移上清；(7)加上清等体积的氯仿，上下颠倒数分钟，13,200rpm 离心15min，转移上清；(8)加上清体积2倍的冰乙醇，1/5体积醋酸铵，上下颠倒数分钟，然后-20o C放置30min；(9)12000rpm 5min，用75%的乙醇洗涤沉淀2次，风干，加适量的MiniQ溶解沉淀。
2.2.2 CHD基因引物的设计我们比对了已知的雉科鸟类的两种Z特异及W特异的同源片段，根据两端的保守序列设计出一对新的通用性强的引物对—CHD-L (5’-CGYCAGTTTCCYTTYCAG-3’ Y=C/T)/CHD-R (5’- CCTTTTATT GATCCATC AAGTC-3’)。
如图2-1所示，CHD-L引物位于2550F引物的下游95 bp处，CHD-R 引物位于2718R引物的上游35 bp处。