荧光分光光度计的原理 及应用
2018/11/13
第一节 荧光分光光度法原理
一、分子荧光的产生
1.电子激发态的多重度
单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电 子配对。
三重激发态T：电子 自旋方向和处于基态 轨道的电子平行。
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2. 分子能级与跃迁
基态 ( S0 )→激发态 ( S1、S2 激发态振动能级 ) ：吸收特 定频率的辐射。 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最 快、激发态寿命最短的途径占优势；
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仪 器 光 路 图
问 题 ： 参 考 光 电 管 作 用 ？
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第三节 荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；
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第二节 荧光分光光度计的组成
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色器 ； 光源：氙灯 ? 和高压汞灯， 染料激光器 检测器：光电倍增管。
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
(2)生物与有机化合物的分析
见表
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作业
• P14 3
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固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧
光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图中曲线I
） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最
多，荧光强度最大；
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2.荧光光谱
固定激发光波长, 化合物发射的荧光强 度与发射光波长关系 曲线(图中曲线II)。 问题：荧光(磷光)的 激发光波长如何选择 ？Stokes位移：激发 光谱与发射光谱之间 的波长差值。发射光 谱的波长比激发光谱 的长。
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三、荧光强度和溶液浓度的关系
1 定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc （浓度高时 如何？）
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
Байду номын сангаас振动弛预
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内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l 2018/11/13 1
l2
l 2
l3
二、激发光谱与荧光光谱
1.荧光的激发光谱曲线
（1）灵敏度高 比紫外 - 可见分光光度法高 2 ～ 4 个数量级；为什 么？ 分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差 别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度 。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱 ； （3）试样量少 （4）可提供比较多的物理参数 缺点：应用范围小。
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三、荧光强度和溶液浓度的关系
2 定量方法
标准曲线法定量： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标 准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度
，在标准曲线上求出浓度；
比较法定量：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比
较。
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四、荧光、磷光分析方法的特点