这是我整理的老师布置的思考题，不一定齐全也不一定正确，不过可以选择性地参考下。

1、DNA提取常见问题，原因分析及其对策问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因：1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子对策：1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题二：DNA降解。

原因：1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融对策：1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三：DNA提取量少。

原因：1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失对策：1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒2、猪肝脏总RNA的提取？RNA提取常见问题，原因分析及其对策问题一：RNA的降解（1）新鲜细胞或组织的RNA降解RNA降解：1.裂解液的质量2.外源RNase的污染3.裂解液的用量不足4.组织裂解不充分5.另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA 的降解。

建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

（2）冷冻样品的RNA降解1.样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。

样品要相对小一点；2.先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。

问题二：OD260 /OD280 比值偏低（1）蛋白质污染；（2）苯酚残留；（3）抽提试剂残留；（4）设备限制。

问题三：电泳带型异常（1）非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。

（2）变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；（3）甲醛的质量不高问题四：下游实验效果不佳（1） RNA 降解；（2）抽提试剂的残留；（3）样品中杂质的残留；（4）DNA 污染。

3、已知单链RNA的序列，分别用sanger和化学裂解法测定其序列，写出操作过程。

Sanger双脱氧链终止法：1.分离待测核酸模板2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。

当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。

ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。

所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。

根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

化学降解法测序：（1）待测模版DNA分子的制备：一般用限制性内切核酸酶将待测DNA分子切割成250~300bp的片段，然后用碱性磷酸酶除去DNA片段5’端的磷酸根，最后用T4多核苷酸激酶和[r32P]ATP，使DNA片段的5’端带上放射性核酸标记。

（2）化学降解待测模版的DNA分子：纯化并碱变性待测DNA片段，回收其中的一条单链，分装在4支试管中进行上述4组特异性切割反应。

4组反应分别产生大小不同且具有共同标记末端的寡核苷酸片段混合物。

（3）待测模版DNA分子的序列分析：通过聚丙烯酰胶凝胶电泳将上述4组反应的寡核苷酸片段进行分离，经放射自显影后即可从X光片上读出DNA 序列。

4、实验设计：DNA片段之间的连接带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。

因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。

利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。

如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。

1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA 可以定向插入到载体中。

2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。

3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。

粘性末端连接：实验试剂：用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。

如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。

通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。

）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇；500μl/ml BSA（可用可不用）T4DNA连接酶5mM ATP实验步骤：1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。

2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴5分钟使重新退火的粘端解链，迅速将混合物转入冰浴。

3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补至10μl。

2、盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心5秒。

3、12℃下过夜连接反应。

4、反应结束后于－20℃保存。

5、再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA 片段。

如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。

可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。

注意事项：1、连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃过夜。

2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。

二者连接效率不同。

粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

3、碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。

这样就会出现DNA自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。

5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。

若连接成功，则说明有效。

5、在进行DNA重组研究时，如何防止DNA酶Ⅰ的污染。

高温、EDTA、冰上操作6、为了从生物材料中高效提取RNA，如何控制RNA酶活性，消除RNA酶的降解活性？（一）消除生物材料内源性RNA酶的干扰主要是在组织细胞裂解液中介入RNA 酶抑制剂和变性剂，如异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素。

由于RNA酶活性的最适PH 接近中性，因此组织细胞裂解液的PH偏碱性或偏酸性可部分抑制RNA酶的活性。

（二）消除制备RNA过程中外源性RNA酶的干扰，可采取以下措施：①对于制备RNA所用的试剂，一般应该用0.1%DEPG处理过的水配制，在37℃处理12小时以上，然后高压灭菌并除去残留的DEPG。

②对于玻璃器皿用180℃干烤3小时以上；对于塑料器皿，用氯仿充分冲洗。

③制备RNA的过程在超净工作台中进行。

④在制备RNA时操作者应戴口罩和一次性手套，且勤换手套。

7、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得该基因？利用染色体歩移的方法以获得与已知序列相邻的未知序列，从而获得该基因8、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得该基因？直接设计引物然后用延伸性好一点的酶直接PCR9、已知蛋白质的部分氨基酸序列，怎样克隆编码该蛋白质的基因？在蛋白数据库搜索同源蛋白,然后对应搜出的基因，设计引物PCR作出全长10、已分离纯化某蛋白质并制备了相应的抗体，如何克隆其编码基因？用抗体纯化出正在翻译的蛋白质，得到其RNA，然后逆转录得到其DNA后设计引物然后进行PCR11、如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其结构功能？12、如何选择合适的转化外植体？（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。

尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。

（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。