❖ 100ml RIPA Buffer： 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.（100元）
说明： 1. 裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的PMSF或其它蛋
白酶抑制剂。 2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用
Y-X-抗X
问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？
CO-IP应用与IP区别
❖ 测定两种目标蛋白质是否在体内结合 ❖ 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档
CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗 原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）
实验基本原理
❖ 1.提取蛋白 ❖ 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体 ❖ 3.孵育后再加入Protein A或G(于
Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目
的蛋白，就可以形成复合物： “Y—X—抗X抗体—Protein A或 G" ❖ 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳， 复合物又被分开。（xy抗原、x抗 体）
agarose bead 琼脂糖珠 proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合
❖ 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞 内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用 非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞 的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
❖ 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解 液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
RIPA裂解液--普利莱基因技术有限公司
标难曲线只对同
一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。
WB结果分析
ECL 试剂 ++
一抗 一抗
二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG) 一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
X光片曝光显影
ECL
CO-IP与质谱分析流程
三 实验的关键
❖ 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 ❖ 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
仪器、耗材
摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制 冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子
（乙醇洗干净风干）
免疫共沉淀
（Co-Immunoprecipitation， Co-IP） 单系金
一 实验原理
以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的 用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确 定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用 的有效方法。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
（2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以 避免人为的影响
（3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物
二 CO-IP特征
局限性
（1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用
（2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三 者在中间起桥梁作用；
（3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最 后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结 果。
改用高严谨度裂解液
❖ 实验仪器或液体被污染
使用洁净的仪器或液体
❖ 转移膜上的非特异吸附 转移面
戴手套， 用镊子夹取， 不要接触膜
试剂
❖RIPA Buffer ❖ 蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、
pepstatin）、PMSF。 ❖ 洗涤缓冲液PBS ❖Protein A agarose琼脂糖 ❖ 抗体
CO-IP原理图解
proteinA/G-琼脂糖珠复合物
❖ Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异 性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。
❖ 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。
ProteinA/G的作用及具体原理
❖ “捕获”抗体，形成复合物，
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子，PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)
↓
离心去PA珠子，取上清
↓
测蛋白浓度 (BCA法)
↓
加一抗反应(4℃过夜)
↓
加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜)
↓
离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍
↓
上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子
↓
↓
四 实验结果分析
❖ SDS-PAGE ❖ Western blotting分析 ❖ 质谱分析检测目的蛋白
SDS-PAGE结果分析
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm）
溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对 数对它的相对迁移率作图得标 准曲线，量出未知蛋白的迁移 率即可测出其分于量。
刘岩 BC300 buffer 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 10% glycerol（甘油）, 0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20
2.1免疫沉淀中抗体的选择
注意的问题：2.2抗体
❖ 使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，
剂，低温下进行实验。 ❖ 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不
能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多 则抗原被稀释。 ❖ 4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解 才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？？
注意的问题：1.裂解液
❖ 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位
❖ 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液
目得蛋白高背景：
❖ 可能原因
处理方法
❖ 非特异蛋白结合
在无血清培养液中裂解细胞；
在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗，
免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）
❖ 裂解液严谨度太低
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合
ProteinA/G-garose beads
共价结合
❖ 加样缓冲液-煮沸变性-离心
Protein A/G beads↓
❖ EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。
二 CO-IP特征
优点
（1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于 天然状态
用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
可能原因
处理方法
❖ 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰 上操作并防止冻融
❖ 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度
❖ 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体
❖ 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥
Bradford法但可用BCA法或 细胞裂解液： 50mM Tris-HC（lpH7.5）， 150 mM NaCl, 0.5%NP-40, 1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail（混合物）。