手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量王文娜 邓桂凤 张玲娣 姚彤炜3(浙江大学药学院药物分析和药物代谢研究室,杭州310031)摘 要 采用Chiral pak AD 2H 手性柱(250mm ×416mm,5μm ),建立了正相高效液相色谱(NP 2HP LC )法直接拆分恩替卡韦与其光学异构体的方法。
考察了流动相组成、酸碱性对柱效、分离度、保留时间等参数的影响。
经优化,以正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(70∶12∶18∶0105∶0105,V /V )为流动相,流速015mL /m in;检测波长261n m 。
在此条件下,恩替卡韦与光学异构体分离度>412;光学异构体的检出限为0112mg/L ,在0125～410mg/L 浓度范围内有良好的线性关系;日内与日间精密度RS D <410%;按标准加入法计算,加样回收率在8710%～10018%之间;RS D <310%;按外标法计算,加样回收率在9812%～11014%之间;RS D <310%。
本方法可作为恩替卡韦原料药中光学异构体杂质限量的控制方法。
关键词 恩替卡韦,光学异构体,高效液相色谱法,手性拆分 2008212229收稿;2009204229接受3E 2mail:rethe m@1 引 言慢性乙肝病毒感染一直是全球公共卫生的难题,开发抗乙肝病毒药物也一直是个热点。
目前,我国临床上应用的抗病毒治疗药物主要有两类:α2干扰素和核苷或核苷酸类似物,主要包括拉米夫定、阿德福韦和阿昔洛韦[1,2]。
2005年3月美国F DA 批准了新一代抗HBV 核苷类似物恩替卡韦(entecavir, 图1 恩替卡韦及其光学异构体的化学结构Fig .1 Structures of entecavir and its op tical is omerET V,商品名Baraclude )上市[3]。
恩替卡韦是一种鸟嘌呤核苷类似物(图1),在磷酸激酶的作用下在体内形成活性三磷酸化合物,拮抗HBV 所需天然底物脱氧鸟苷三磷(dGTP ),抑制HBV 2DNA 聚合酶和逆转录酶,阻断HBV 复制。
细胞内作用半衰期为15h,在人体内不被肝细胞代谢,主要从肾脏排出体外。
同时,其耐药性好,可有效治疗慢性乙型肝炎,临床应用前景良好[4,5]。
由于手性药物在合成过程中可能引入光学异构体杂质,故采用手性分离方法检查合成产品中光学异构体含量。
恩替卡韦及其光学异构体手性分离方法未见报道。
本研究采用直接手性HP LC 法拆分两光学异构体,建立恩替卡韦中光学异构体杂质限量检查方法。
2 实验部分211 仪器、试剂及材料LC 210A 型高效液相色谱仪、SP D 210A 型紫外可见光检测器(日本岛津公司);Chiral pak AD 2H 手性柱(250mm ×416mm ,5μm ,日本D iacel 公司)。
乙醇(TE D I A )、正己烷(Burdick &Jacks on )及异丙醇(TE D I A )均为色谱纯;三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司);三乙胺(分析纯,上海化学试剂采购供应五联化工厂);恩替卡韦及其光学异构体(99187%,浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。
212 色谱条件色谱柱:Chiral pakAD 2H 手性柱;流动相:正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(70∶12∶18∶0105∶0105,V /V );流速015mL /m in;检测波长261nm;柱温:室温;灵敏度:01005AUFS;进样量20μL 。
第37卷2009年8月 分析化学(FE NX I HUAXUE ) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry 第8期1206～1210213 溶液制备21311 恩替卡韦供试液及自身对照液的制备 准确称取适量恩替卡韦于50mL 容量瓶中,加乙醇超声溶解,定容,作为储备液(500mg/L )。
准确移取储备液2mL 于10mL 容量瓶中,加正己烷2异丙醇(50∶50,V /V )混合溶液(以下简称混合稀释液)定容,得恩替卡韦的供试品溶液(100mg/L )。
取适量供试品溶液,用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。
21312 光学异构体对照品溶液的制备 准确称取适量异构体于100mL 容量瓶中,加乙醇超声溶解,定容,作为异构体的储备液(50mg/L )。
准确移取储备液2mL 于10mL 容量瓶中,加混合稀释液定容,作为异构体的对照品溶液(10mg/L )。
21313 恩替卡韦与异构体混合溶液的制备 取2mL 恩替卡韦供试品溶液和4mL 异构体的储备液于10mL 容量瓶中,加混合稀释液定容,即得浓度各为20mg/L 的混合溶液。
3 结果与讨论311 不同极性调节剂对保留时间、柱效和分离度的影响由表1可见,当流动相为正己烷和异丙醇时,调节比例,样品和异构体未达基线分离。
加入三氟乙酸,保留时间随着三氟乙酸的增加有所减少,仍未达基线分离,但峰型好。
加入三乙胺,两者未分开,但能使异构体的保留时间缩短。
再改变正己烷和异丙醇比例,两者分离,但是分离度仅为1118,理论塔表1 流动相的优化Table 1 Op ti m izati on of mobile phases流动相Mobile phase组成Compositi on (V /V )分离度Res oluti on保留时间Retenti on ti m e (m in )t R1t R2理论塔板数Theoretical p lateN 1N 2正己烷2异丙醇N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol 60∶40<11336174770∶30<119722787正己烷2异丙醇2三氟乙酸N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol ∶trifluor oacetic acid60∶40∶0105<11227155860∶40∶011<11114113174正己烷2异丙醇2三氟乙酸2三乙胺N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol ∶trifluor oacetic acid ∶triethyla m ine 60∶40∶011∶0105<1815680∶20∶011∶010511182213627106589639正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol ∶ethanol ∶trifluor oacetic acid ∶triethyla m ine80∶15∶5∶011∶010521182911938194107782675∶15∶10∶011∶0105218123194311821768145270∶18∶12∶011∶0105119416156201201701141270∶15∶15∶011∶0105218018157241042045178370∶12∶18∶011∶01053175211632917423062198板数都小于650。
在流动相中加入乙醇后发现流动相中的乙醇含量明显影响保留时间、分离效果和理论塔板数。
乙醇含量越高,理论板数越大。
同时乙醇和异丙醇的比例也明显影响分离效果,乙醇比例增高,分离度和理论板数提高,保留时间也增加。
当流动相为正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(70∶12∶18∶011∶0105,V /V )时,分离效果理想(图2C )。
312 酸碱性对柱效、分离度和保留时间的影响31211 三乙胺的影响 固定流动相中正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸(70∶12∶18∶011,V /V )的比例,改变三乙胺用量,考察三乙胺含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。
由表2可知,随着三乙胺含量增加,理论板数和分离度逐渐提高,保留时间稍有缩短。
当流动相中三乙胺比例为0105%和011%时,理论板数、分离度和保留时间基本一致。
考虑到碱性大对手性柱的损害大,故选择三乙胺用量为0105%。
31212 三氟乙酸的影响 固定流动相中正己烷2异丙醇2乙醇2三乙胺(70∶12∶18∶0105,V /V )的比例,改变三氟乙酸用量,考察三氟乙酸含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。
由表2可知,随着三氟乙酸含量的增加,分离度逐渐降低,但均大于315。
保留时间逐渐变小,理论板数变化不明显。
综合考虑选择三氟乙酸含量为0105%。
7021第8期王文娜等:手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量图2 流动相对恩替卡韦及其光学异构体分离的影响Fig .2 Chr omat ogra m s of m ixture of entecavir and its op tical is omer in different mobile phaseA.正己烷2异丙醇2三氟乙酸(N 2hexane:is op r opyl alcohol:trifluor oacetic acid )(60∶40∶0105,V /V );B.正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(N 2hexane:is op r opyl alcohol:ethanol:trifluor oacetic acid )triethyla m ine (TEA )(75∶20∶5∶011∶0105,V /V );C .正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(N 2hexane:is op r opyl alcohol:ethanol:trifluor oacetic acid:TE A )(70∶12∶18∶011∶0105,V /V )。
表2 流动相中三乙胺和三氟乙酸含量对恩替卡韦光学异构体拆分的影响Table 2 I nfluence of TE A in mobile phase on chiral separati on of entecavir试剂Reagent含量(%)Concentrati on分离度Res oluti on 保留时间Retenti on ti m e (m in )t R1t R2理论塔板数Theoretical p latesN 1N 2三乙胺TEA0210926113341639078690102531292015327178200718420105317521163291742306219801103183211062914322222054三氟乙酸Trifluor oacetic acid041642410635156231622960102541492213932154240323200105412922102311482316229601103175211632917423062198313 系统适用性、检出限和线性关系取配制的恩替卡韦与异构体的混合溶液,连续进样5次,记录峰面积,得恩替卡韦峰面积RS D 为213%,光学异构体RS D 为311%;分离度为413;恩替卡韦的保留时间约为21～23m in;光学异构体的保留时间约为30～33m in 。