理想的基质应满足以下要求： ① 高度的亲水性。 ② 极低的非特异性吸附性（惰性）。 ③ 具有足够的化学基团。 ④ 适当的多孔性。 ⑤ 较好的理化稳定性。
配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的 一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶 等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。

8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 离子强度 pH值 抑制氢键形成的物质 温度 离液离子 螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性，如蛋白酶与辅酶、抗原 和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧 核糖核酸等体系，都具有这种特性，生物分子间的 这种专一结合能力称为亲和力。 依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可 逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有 特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则含 有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相后， 可把目的产物从混合物中分离出来，此中分离技术 称为亲和层析。
亲和色谱（Affinity chromatography）
载体活化、配基连接、吸附、洗脱
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基
2）引入连接臂（space arm）
又称手臂（spacer ）
“接臂” 的目的：
克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。
“接臂”的途径：
常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如： AH-Sepharose 4B
生物和酶的侵蚀；⑥最好为粒径均一的球形粒子。常用的载
体有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年来多孔硅胶和合成高分子 化合物载体正在被开发应用于亲和层析。
基质的选择 可被应用的基质（载体）：
（按性能优劣排序） 琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝 胶、纤维素。
最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
图7-14 间隔臂的作用
8.3 亲和色谱介质
8.3.2 亲和吸附剂及其制备方法
偶联（亲和吸附剂的制备）
配体一定，改造载体（基质）
1）基质活化：
不同的载体活化需要不同的活化剂。
常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、 1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。
溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。
亲和配基可选择酶的抑制 剂、抗体、蛋白质A、凝集素、 辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色 素、、组氨酸和肝素等。当配 基的分子量较小时，将其直接 固定在载体上，会由于载体的 空间位阻，配基与生物大分子 不能发生有效的亲和吸附作用， 如图7-14a所示。如果在配基与 载体之间连接间隔臂，可以增 大配基与载体之间的距离，使 其与生物大分子发生有效的亲 和结合，如图7-14b所示。
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质 相互作用：
静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
钥匙和锁孔的关系
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
生物体内相互作用的分子对： (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 (2) 抗原—抗体。 (3) 激素—受体。 (4) 糖蛋白与凝集素, (5) 生物素—生物素结合蛋白等
Often need spacer armSpace Nhomakorabea arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
图8.2 亲和色谱操作示意图
8.2 亲和色谱原理
图8.2 所示为亲和层析分离示意图。把具有特异亲和力 的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能的 情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入层析柱中 （如图8.2中a），然后把含有目的物质的混合液作为流动 相，在有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条件下 进入层析柱。这时，混合液中只有能与配基发生结合反应 形成络合物的目的物质（图8.2中· 分子）被吸附（如图8.2 中b ），不能发生结合反应的杂质分子（图8.2中△分子） 直接流出。经清洗后，选择适当的洗脱液或改变洗脱条件 进行洗脱（图8.2中c），使被分离物质与固定相配基解离， 即可将目标产物分离纯化。
8.2 亲和色谱原理
8.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰 固体粒子，以制备所需的亲和吸附介质（固定相）。固体粒 子称为配基的载体。作为载体的物质应具有：①不溶性的多 孔网状结构，渗透性好；②物理和化学稳定性高，有较高的 机械强度，使用寿命长；③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固定化；⑤抗微

在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。 配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称为 载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酞胺凝胶和纤维素等。 当用小分子化合为作为配基时，由于空间位 阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常 在母体与配基之间引入适当长度的连接臂。


要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶 联，必须先使母体活化。即通过某种方法(如溴化 氰法、叠氮法等)，使母体引入某一活泼的基团， 才能以共价键与配基偶联。活化后的不溶性母体已 有商品出售。商品名为偶联凝胶。
手臂
作用 ：减少亲和作用空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接 手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH 环氧氯丙烷 1，4- 丁二醇缩水甘油醚
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
8.3 亲和色谱介质
8.3.1 亲和配基 酶的抑制剂 抗体 A蛋白 凝集素 辅酶和磷酸腺苷
色素配基
过渡金属离子 组氨酸
肝素
8.3 亲和色谱介质