第31卷第4期黄牛杂志VO1.31NO.4 2005年7月JOurnal Of yellOW Cattle Science Jul.2005文章编号:1001-9111(2005D04-0062-04分子生物学技术在反刍动物营养中的应用韩爱云黄仁录李建国(河北农业大学动物科技学院河北保定071001D摘要:本文对利用分子生物学技术改造或生产动物性营养物质;在分子水平上研究营养与基因表达~调控的关系以从根本上阐明营养对机体的作用机制;利用基因工程技术开发饲料资源等三个方面进行了综述O最后探讨了分子生物学在动物营养中的存在问题及应用前景O关键词:分子生物学;基因表达;分子营养;微量元素中图分类号:S813.3文献标识码:A近几十年来随着分子生物学理论及实验技术在生命科学领域各学科的渗透及应用产生了许多新兴学科其中分子生物学原理和技术与动物营养学的有机结合产生了分子营养学O虽然分子营养学的提法颇有争议但动物营养的诸多方面研究确实已经进入到分子水平[1]O分子生物学技术在动物营养学中的应用主要包括:利用分子生物学技术改造或生产动物性营养物质;在分子水平上研究营养与基因表达~调控的关系以从根本上阐明营养对机体的作用机制;利用基因工程技术开发饲料资源等O 本文就以上三个方面进行简要介绍O1利用分子生物技术改造或生产动物性营养物质1.1促进动物生长自Palmiter(1982D等获得超级巨鼠以后大大鼓舞了科学家利用转基因技术探索改良畜禽品种的热情O对家畜的转基因研究最早是向家畜体内导入生长激素(G~D基因人们以此期望提高家畜的生长速度改善饲料报酬O目前已有不同结构的G~基因序列已经在羊上进行了移植但还没有比金属硫蛋白启动子调控的G~基因序列更成功的O在金属硫蛋白基因启动子调控的G~基因中OMTSG~-10是在绵羊上应用的很有前景的一种结构形式OWard和BrOWn等报道OMTSG~-10转基因羊经历了3个繁殖周期动物的健康状况良好并且还发现转基因羊在4个月以后生长速度与对照组相比快15%~20%胴体瘦肉率也得到显著提高O1.2改善畜产品质量外源基因不仅能在转基因动物中得到整合和表达而且能获得组织特异性(乳腺组织D和发育特异性表达O因此只要转入相关的基因不仅可以提高产乳~肉~皮~毛等畜产品的产量而且也可以改变畜产品的质量这是常规育种和突变方法所不能完成的O 1.2.1改善产乳性状外源基因在乳腺中的表达可改变乳汁的成分它的应用有两个方面:一是提高乳汁的营养价值如导入乳铁蛋白基因提高乳铁蛋白在乳中的含量弥补牛奶中铁含量的相对不足;导入溶菌酶基因可以降低乳中细菌的含量O英国培育出一只转基因绵羊其乳中含人G1-抗凝蛋白酶含量高达30mg/mL O对于乳用家畜天然乳汁中的溶菌酶水平较低可能是导致乳房炎高发病率的主要原因而人乳中溶菌酶含量比牛~绵羊和山羊乳中含量高出1500~4000倍O Murray等将人乳溶菌酶基因导入小鼠获得了有活性的乳腺专一性表达通过这一途径有可能实现对乳用家畜乳用成分的改良乳汁成份中溶菌酶含量的提高不仅可以减少乳畜乳房炎的发生还能延长奶的保鲜期O另外研究证明牛奶常使人感染结核杆菌而马乳脂具有抗牛型结核杆菌的作用肉用马乳腺细胞基因改造牛奶品质即可起到治疗结核病的作用O二是生产药用蛋白[2 3]O胰岛素牛奶~生长激素山羊奶可治疗血友病的凝血因子IX的山羊奶以及带有疟疾裂殖体表面蛋白(MSP-1D的疫苗山羊奶均已取得成功O收稿日期:2004-08-02作者简介:韩爱云(1981-D女河北石家庄人河北农业大学在读硕士研究生研究方向为动物营养与饲料科学O1998年10月我国上海医学遗传所与复旦大学合作由曾溢滔~黄淑帧[4]教授主持成功培育出5只<3只公2只母)有目的基因<人凝血因子IX)整合的转基因羊其中一只母羊已于1997年9月产羔开始泌乳其乳汁中有活性凝血因子IX表达可治疗血友病,1.2.2改善肉质许多研究都已证实G 具有明显抑制脂肪生成的作用而且还有一定的催乳特性转有G 基因的家畜体脂减少瘦肉率明显提高,肌肉抑制素基因与双肌动物肌肉抑制素<MStn)基因是小鼠转化生长因子-B<TGB-B)超家族的一种新基因生长/转化因子8<GDF-8)仅在骨骼肌特异表达,1997年Mcpherron[5]等通过兼并引物PCR法鉴定出GDF-8编码长367个氨基酸残基的蛋白质其生物学活性类似于消瘦激素因此被称为肌肉抑制素基因<MyoStatin MStn),双肌表型<double-muSledphenotype)在几个牛品种均有发现其中比利时蓝是最著名的双肌良种牛其骨骼肌肉较一般的品种重20%左右它的MStn基因DNA序列与野生牛基本相同仅在821~831位核苷酸缺失11bp这样就改变了下游氨基酸的序列并在14个密码子位置上出现1个成熟密码子这种突变消除了MStn分子的活性部位从而导致双肌隐性表型的发生,通过基因打靶定点突变S细胞的GDF-8基因使其表达的蛋白失活重植入小鼠胚胎获得GDF-8基因突变嵌合体小鼠杂合体的体重比野生型大70%左右且体重的增加是由于肌肉细胞的增生及部分肥大肌肉的重量比野生型大2~3倍,1.2.3提高产毛性能通过一定的导入途径将G 基因导入产毛家畜可提高产毛家畜的生长速度并增大其体型进而提高产毛量,除此之外还可以导入一些与产毛性能有关的基因如半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸由于半胱氨酸在羊瘤胃内降解故在饲料中添加半胱氨酸并不能提高其在血清中的水平,如果羊自身能合成半胱氨酸将会提高羊毛产量,Ward等将大肠杆菌中编码丝氨酸转乙酰酶<SAT)~D-乙酰丝氨酸硫氢化酶<DAS)基因和金属硫蛋白<MT)启动子联接并在3端装上G 基因的序列然后通过转基因技术将这一构件导入羊体内得到的转基因羊胃上皮细胞能利用胃中的硫化氢合成半胱氨酸,此外PoWell等将毛角蛋白I型中间细丝基因导入绵羊基因组转基因羊毛光泽亮丽羊毛中羊毛脂的含量得到明显的提高,最近已有报道带有提高羊毛产量特征的转基因已产生,目前人们已开始用转基因手段培育超细型细羊毛并准备将彩色毛基因导入绵羊以生产彩色羊毛这无疑对羊毛生产及纺织业带来巨大影响,1.1.3动物生物反应器动物生物反应器<Mammary Bioreactor)是九十年代初才出现的一种利用动物乳房作为生物发酵工厂来大规模地生产可供人类疾病治疗和保健使用的药用蛋白的生物高技术,1991年,Wright等人在羊的乳房中成功地表达了人抗胰蛋白酶基因<ATT)人抗胰蛋白酶<一种治疗肺泡纤维化病肺气肿的高效药用蛋白)在羊奶中的含量高达35g/L,这个研究结果即引起了科学界和企业界的巨大轰动世界上许多科学家把研究的兴奋点转向乳房生物反应器大量的风险资金也投向开发动物乳房生物反应器目前全球有20多家公司在利用动物乳房生物反应器技术进行产业化开发1.1.4其它加拿大的科学家利用将蜘蛛的基因注入一只特殊培育的褐色山羊体内后使山羊产下的羊奶变成了含有比钢铁强度高10倍~但却保持柔韧特性的物质,科学家们给这种物质起了一个名字叫生物钢,它比医学上用于手术的手术线还要坚固~柔韧许多同时生物钢还可用于导弹防御和航空航天[6],2日粮营养与基因表达~调控的关系机体从受孕~细胞分裂~分化到生长发育从健康状态~疾病状态到死亡等一切生命现象无一不是对基因表达调控的结果,而环境因素尤其是营养或营养素对基因表达会产生直接或间接作用从而对上述生命现象产生重要影响,从精子与卵细胞结合的一刹那就决定了一个个体的遗传学命运,营养素虽然在短时间内不能改变这种遗传学命运但可通过营养素修饰这些基因的表达从而改变这些遗传学命运出现的时间进程,目前从分子水平研究日粮营养对动物代谢调控的研究多集中在日粮营养与基因表达调控的关系它表现在以下两个方面:一是养分摄入量和种类影响基因表达及蛋白质的合成;二是基因表达结果影响养分代谢途径和代谢效率并决定动物需要量,以下主要从第一方面进行简要介绍,2.1营养对基因表达调控的方式及途径基因表达是指编码某种蛋白质的基因从转录~mRNA的加工与成熟~RNA的翻译~蛋白质的加工到活性<功能)蛋白质的形成的过程<Goodridge1994),基因表达受到严格的调控这些调控包括转36第4期韩爱云等:分子生物学技术在反刍动物营养中的应用录调控~RNA加工调控~RNA转运调控~翻译调控~mRNA稳定性调控及翻译后的调控G每一个调控点都与养分直接或间接有关G研究表明营养对基因表达的作用主要发生在转录或翻译前水平上对翻译后的影响较小[7]G其调控的关键控制点包括,对mRNA5/和3/非翻译区(UTR)的调节[8]核内mRNA加工的调节[9]mRNA的翻译[10]mRNA的稳定性[8]mRNA的定位[8 9]等G营养对基因表达的调节方式有2种,即直接作用和间接作用G首先直接调控就是营养素可与细胞内组分通常为调节蛋白(包括转录因子)作用从而影响基因的转录速度及mRNA的丰度和翻译G第二种方式即为间接作用特殊营养物质摄入可诱导次级介质(Secondary mediator)的出现其中包括许多信号传导系统~激素和细胞分裂素等G2.2几种营养素对基因表达的调控2.2.1碳水化合物高碳水化合物饲粮促进脂肪的合成其作用涉及基因转录~mRNA的加工和稳定性[11]G肝细胞的基因转录的诱导速度很快G大鼠肝细胞在蔗糖介质中培养2h脂肪酸合成酶及S14 mRNA水平增加10~15倍;绝食大鼠饲喂高碳水化合物饲粮后肝中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶mRNA量在4~6小时内提高7倍G此外碳水化合物对ATP-柠檬酸裂解酶~甘油-3-磷酸乙酰转移酶~硬脂酞oA脱饱和酶等基因表达的促进作用也是发生在转录调节环节G碳水化合物中起调节作用的关键成分是葡萄糖目前已鉴别出了L-PK. S14和A 基因中的葡萄糖作用区G2.2.2胆固醇胆固醇可抑制合成其本身过程中的酶(羟甲基戊二酸单酰OA合成酶)或它从外界被吸收时发挥作用的酶-LDL受体(低密度脂蛋白受体)基因的表达G在胆固醇缺乏时这些酶可被称为固醇调控元件结合蛋白的转录因子(SREBP)所激活G SREBP通常存在于内质网上在适当的条件下可被蛋白酶切下而后进入核从而激活有关基因的转录G而在高胆固醇存在条件下这种蛋白酶被钝化SREBP不再进入核从而不能激活有关的基因的转录G2.2.3蛋白质和氨基酸日粮蛋白质是以特定的单个氨基酸的形式通过调节IGF-I mRNA的基因表达而对GHR mRNA没有明显的直接影响[12]G Ogawa等[13]和Oka等[14]研究证实组氨酸酶和白蛋白mRNA在肝脏的表达随着日粮蛋白质或氨基酸供给的增加而提高G2.2.4维生素脂溶性维生素主要是对mRNA在转录水平上进行调控而水溶性维生素特别是B族维生素是动物体内许多代谢酶的辅酶参与广泛的营养代谢调节作用G在翻译后生物素蛋白连接酶(BLP)通过两步反应以酰胺键连接到新合成的羧化酶的特定赖氨酸残基上G BLP缺乏导致4种生物素羧化酶水平都降低[15]BLP前导序列决定其在翻译后的定位[16]G2.2.5脂肪酸降低动物肌肉中脂肪比例的另一方法是通过配合日粮减少胰岛素的分泌G研究证明牛的胰岛素可提高脂肪酸合成基因的活性G在胰岛素分泌过程中丙酸盐是一个主要的调节因子而乙酸盐却是非胰岛素刺激能量的物质所以通过在日粮中添加缬氨酸或富含缬氨酸的蛋白质以增加乙酸盐的相对比例有可能降低胰岛素的分泌从而降低脂肪酸合成基因的表达G2.2.6微量元素2.2.6.1铁铁的吸收与转运需要运铁蛋白及其受体的参与而铁蛋白是铁在体内的贮备形式和高剂量铁的解毒形式两种蛋白的表达均受翻译后调节机制的调控G运铁蛋白受体mRNA的3 UTR上含有铁调节区(IRE)G缺铁时铁调节蛋白(IRP)就与IRE结合保护mRNA使其不被RNA裂解酶降解从而提高运铁蛋白受体的水平G当有铁存在时IRP就脱离mRNA分子失去保护的mRNA不稳定其翻译率下降从而导致运铁蛋白受体的合成量减少铁的吸收率下降G铁的状况并不影响运铁蛋白受体基因的转录G但Zakin的综述指出虽然很多组织都含有运铁蛋白基因但不同组织的基因含有不同的转录调节因子使运铁蛋白基因的表达具有明显的组织特异性G2.2.6.2锌金属硫蛋白(metallo thionein MT)可以结合多种金属元素是元素转运~维持细胞中的元素平衡~防止重金属中毒所必需的蛋白质G ui用大鼠试验表明饲粮缺锌可明显降低肝脏~肾脏和小肠MT-1mRNA水平但给大鼠注射白细胞介素-I后MT-1mRNA明显升高且缺锌组的MT-1 mRNA水平显著高于加锌组G在不同生理状态下锌对MT-1的调控性质完全不同G尽管认为MT是金属元素转运的必需蛋白质但Davis(1998)的研究表明MT过度表达(用转基因技术)的小鼠锌的吸收率下降G Andrews(1999)报道妊娠小鼠日粮缺锌时提高MT-1MT-2的表达可以改善母鼠的繁殖成绩G因此MT的作用与表达及其与锌代谢的关系尚需深入研究G2.2.6.3硒46黄牛杂志第31卷硒以半胱氨酸硒的形式参与硒蛋白(如GS~-Px,碘化甲状腺氨酸一5-脱碘酶)的组成O在硒蛋白翻译过程中,UGA密码子不再作为终止信号,而是作为半胱氨酸硒的编码信号,从而在蛋白中插入半胱氨酸硒O Burk,Bermano[17]研究表明,日粮硒水平不但能够调节硒蛋白的含量与活性,而且可以调节相应的mRNA的量O但对不同组织,不同硒蛋白及其m RNA对不同硒水平的敏感程度存在差异O 如,在硒耗竭时,磷脂过氧化氢GS~一Px mRNA 的降解率不受影响,但胞液GS~-Px mRNA的降解率下降O因此,缺硒时,二种酶的活性不同O不同硒蛋白mRNA的3UTR结构的差异是决定mRNA翻译程度及对硒缺乏的敏感性的关键因素O 2.2.6.4其它添加一定量的铜可诱导肝内脂肪酸合成酶以及线粒体RNA转录因子基因的表达;同时铜可通过提高G~的表达量来促进生长O另外铬可影响多种酶的表达,同时它还能提高生长激素基因的表达从而降低胭体的脂肪;铬同样可以通过提高葡萄糖乳酸盐循环的基因表达来降低血浆乳酸水平O在实际生产中给产奶的青年母牛饲喂铬添加剂,产奶量比对照组增加13%O镉可提高金属巯基基因的转录的速率\铁通过控制mRNA的稳定性,翻译调节转铁蛋白和铁蛋白的水平O3利用基因工程技术开发饲料资源应用生物技术调控动物代谢还可通过对动物肠道内的微生物(主要是反刍动物瘤胃微生物)进行改造,赋予细菌以新的代谢能力,从而使动物获得利用原来不能利用物质的能力O目前,国外已有实验室在进行将白蚁中编码分解木质素的有关酶基因克隆并转给瘤胃微生物的工作,如果获得成功,那么反刍动物对秸秆类饲料的利用效率将大幅度提高,这对于提高饲料资源的利用效率具有重要意义O许多研究成功地将内切葡聚糖苷酶和木聚糖酶等瘤胃微生物基因克隆到其它表达系统中,为将来这些基因插入瘤胃原生的微生物种类中发挥效应作了准备O选择高效的外源基因转化方法和构建良好的表达载体系统,就可能使许多人工设计的基因能插入瘤胃微生物中并得到表达O未来利用基因工程技术开发饲料资源的研究可能侧重以下几个方面加以考虑:研究作物大量表达修饰蛋自的机制,分离克隆富含某种必需氨基酸(如赖氨酸\蛋氨酸)的基因,充分利用反义技术等基因工程技术手段改良饲粮作物蛋白质\脂类\糖类的品质;分离克隆重要饲用酶类的基因,并转入玉米\大豆等大众饲料作物中,利用植物基因工程技术生产出可直接形成配方的饲用酶类;利用酵母基因工程技术开发生物活性肽类\饲用酶类添加剂;利用基因工程技术通过对发酵工程菌的代谢调控来提高饲用抗生素\氨基酸\有机酸\色素的产量;开发可作用疫苗用的饲料作物\工程菌株O4分子生物学在动物营养中的应用前景及存在问题分子生物学在动物营养中的应用还处于初级阶段,还存在着很多暨待解决的问题:(1)转基因动物在获得提高生产性状的同时,也留下一些后遗症,如在G代转基因动物中,死胎和畸形率高,患关节病,胃溃疡\肾病和生殖力丧失症等较为普遍;(2)营养对基因表达影响的研究,绝大多数是以大鼠为试验动物,以家畜为试验动物的研究较少\大鼠的试验结果不一定能适用于家畜O(3)目前营养对基因表达调控的研究是为了阐明营养物质的代谢机理,而肉品性状的相关功能基因表达的营养调控尚未见报道O随着对动物营养和功能的深层了解以及分子生物技术的发展,分子生物技术与传统的营养研究方法相结合研究营养物质分子作用机制,将是未来营养研究的重要领域,必将为畜牧业高效\持续\稳定发展开辟新的广阔前景O参考文献:[1]李德发.营养调控肉品质量的研究现状及发展趋势[A].动物营养研究进展[C].北京:中国农业科学出版社,7-14.[2]Palcyanda R K,Velander W~,Lee T K,et al.Transgenic pig produce functional human factor V inmilk[J].Nature Biotechnology,1997,15:971-975.[3]Schnieke A E,Kind A J,Ritchie W A,et al.~umanfactor X transgenic sheep produced by transfer ofnuclei from transfected fetal fibroblasts[J].Science,1997,278:2130-2133.[4]黄淑帧,陈美珏,黄英等O乳汁中分泌有活性的人凝血因子X的转基因羊的研制[J].科学通报1998,43(7):783-784.[5]McPherron AC,LaWler AM,Lee S J.Regulation ofskeletal muscle mass in mice by a neW TGF-(-superfamily member[J].Nature,1997,387(6628):83-90.(下转第83页)56第4期韩爱云等:分子生物学技术在反刍动物营养中的应用2.2.9其它葡萄球菌食物中毒和副溶血弧菌感染的病程短暂自限 很少有应用抗菌药物的特征 严重亲水气单胞菌 空肠弯曲菌 结肠炎耶尔森菌等感染 特别具有并发症如败血症者宜根据药敏试验 选用氨基糖苷类 红霉素 四环素 多西环素 复方SMTMP 等药物进行治疗 水袋纤毛虫病可采用甲硝唑 替硝唑等进行治疗 噻苯咪唑是治疗粪类圆线虫病的首先药物 毛圆线虫病的治疗同钩虫病 隐孢子虫病可选用红霉素治疗 球虫病可选用地克珠利等抗球虫药物进行治疗 8 O] 参考文献]戴自英.急性感染性腹泻的病因 发病原理和治疗 J ].临床医学杂志 985 (3 43-45.2]吴清民.兽医传染病学 M ].北京 中国农业大学出版社 2OO2 239-5O8.3]彭文伟.感染性腹泻的发病机制与防治 J ].中华内科杂志 982 (2 496.4]郑德联 戴自英.消化道感染研究进展 J ].临床医学杂志 987 (4 2O6-2O8.5]宣长和.猪病学 M ].北京 中国农业科技出版社 996 368-379.6]邝荣禄.禽病学 M ].北京 中国农业出版社 998 98-2O .7]赵德明.奶牛疾病学 M ].北京 中国农业大学出版社 999 2 3-298.8]孔繁瑶.家畜寄生虫病学 M ].北京 中国农业出版社 98 374-4 8.9]Fekety R .Recent advances in management of becterialdiarrhea J ].Rev Infect Dis983 (5 246. 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