仪器分析实验报告
氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定
zuozhe
一、 实验目的
（1）掌握紫外–可见分光光度计的工作原理与基本操作。 （2）学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。 （3）了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。
二、 实验原理
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状 态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。电子由于受到光、热、 电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来 辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。物质对不 同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波 长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度（A）,然后以波长为横坐标，以吸光度 为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。 当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度 I0 与透过光强度 It 之比的 对数与该物质的浓度 c 及厚度 b 成正比。其数学表达式为：
312.87
图 7 对待测波长处的放大图像 根据峰值绘制标准曲线：
仪器分析实验报告
图12 酪氨酸溶液的4阶导数标准曲线 然后带入未知样品在峰值处的一阶导数强度，可以得出c=82.4mg/L。
六、
思考题
（1）本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波长较短的吸 收峰下进行定量测定，为什么？ 答：不可以，因为在波长较短的吸收峰处很窄的波长范围内随λ的变化改变很大， 此工作条件难于控制准确一致，将会影响测定结果的精密度和准确度。 （2）被测物浓度过大或过小对测量有何影响？应如何调整？调整的依据是什么？ 答：浓度过大容易超出线性范围，浓度过小则会造成较大的误差。应当在粗略估 计待测浓度之后将其稀释或浓缩至工作曲线浓度范围内后再进行测量。 （3）思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测 定奶粉中蛋白质的含量。
A log
I0 log T kbc It
（一）
式（一）为 Lambert-Beer 定律，是分光光度法定量分析的基础，其中 T 为透 光率(透射比） 。 物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的 物质，由于分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及 其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。 氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20 种氨基酸在可见光 区域均无光吸收，在远紫外区（<220 nm）均有光吸收，在紫外区（近紫外区） （220 nm—300 nm）只有三种 AA 有光吸收能力，这三种氨基酸分别是苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸，因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸 最大吸收波长在 259 nm、酪氨酸在 278 nm、色氨酸在 279 nm，蛋白质一般都含 有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约 280 nm 波长处，因此能利用分 光光度法很方便的测定蛋白质的含量。 本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量 测定。
仪器分析实验报告
0.21
0.10
0.00
Abs.
-0.10
-0.20
-0.28 201.37
250.00
nm.
300.00
326.03
图 6 不同浓度的酪氨酸 1 阶导数光谱图
0.02
0.00
Abs.
-0.02
-0.04
-0.06
-0.07 276.53
280.00290.00源自nm.300.00
310.00
三、 仪器和试剂
1. 仪器 紫外-可见-近红外分光光度计（UV-2401）；分析天平； 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL移液管若干；10 mL带塞比色管若干。
仪器分析实验报告
2. 试剂 标准溶液(a): 2.0 g/L的苯丙氨酸溶液； 标准溶液(b)：0.4 g/L的酪氨酸溶液； 标准溶液(c)：0.4 g/L的色氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；酪氨酸待 测样。
答：先将蛋白质水解成氨基酸后利用紫外-可见光度法找到每种氨基酸 的特征吸收峰，根据标准曲线计算浓度后即可间接得出蛋白质的含量。
0.09
0.00
Abs.
-0.10
-0.18 201.37
250.00
nm.
300.00
311.19
图 2 苯丙氨酸-酪氨酸 1 阶导数光谱图
0.04
0.02
Abs.
0.00
-0.02
-0.03 200.46
250.00
nm.
300.00
348.40
图 3 苯丙氨酸-酪氨酸 2 阶导数光谱图
仪器分析实验报告
四、
实验步骤
（1）分别移取标准溶液(a)（2.0 g/L，1.0 mL） 、标准溶液(b)（0.4 g/L，1 mL）和标准 溶液(c)（0.4 g/L，0.4 mL）标准溶液于10 mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀， 待用。 （2）分别移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0 mL标准溶液（b）于5个10 mL比色管中，并 用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。 （3）双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自 检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。 （4）在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在 200～350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax 。 （5）在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液 在λmax处的吸光度。 （6）在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。
0.02
0.01
Abs.
0.00
-0.01 201.37
250.00
nm.
300.00
342.24
图 4 苯丙氨酸-酪氨酸 3 阶导数光谱图
0.01
Abs.
0.00
-0.01 202.66
250.00
nm.
300.00
340.52
图 5 苯丙氨酸-酪氨酸 4 阶导数光谱图 由上面 4 幅图可知，1 阶导数光谱图中苯丙氨酸的影响最小，可以用于对酪氨酸的定 量分析。 将不同浓度的酪氨酸的 1 阶导数光谱图绘制如图 6。对于波长为 295 处左右的吸收峰 进行放大，如图 7
五、
数据处理
1． 氨基酸的定性分析
图1 三种氨基酸的紫外吸收峰比较示意图
仪器分析实验报告
通过比较可以发现， 三种氨基酸均具有一个E2带和一个B带。 其中E2带的峰为C≈B<A， 原因是色氨酸的吲哚环以及酪氨酸的羟基均为推电子的助色团，使得E2带红移。此外，B 的B带由于连有-OH，导致其精细结构消失，可能与新生成的R带与B带重叠所致。 由于E1带在小于200nm处才有吸收，因此本图中无法观察到E1带。 2． 酪氨酸的标准曲线绘制以及未知样浓度的测定 以上述步骤6测得的各标准酪氨酸溶液的吸光度为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制 工作曲线，再根据未知溶液的吸光度，利用标准曲线求出待测样浓度。 首先根据酪氨酸标准溶液的紫外光谱图，作出1-4阶导数光谱图。为了比较苯丙氨酸 吸收峰对其的干扰，同时也作出它的1-4阶导数光谱图。