菌种鉴定的分子生物学方法
——16S rDNA 测序鉴定菌种
一． 原理
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。

5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。

而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。

在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。

因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。

随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

二． 技术路线
该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

具体技术路线如下：
三． 方法步骤
（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）
1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。

细菌培养液
基因组DNA
DNA 提取
PCR 扩增
16S rDNA 片段
片段回收
连接克隆载体
阳性克隆鉴定 测序
2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。

37℃放置10分钟。

4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。

再加入3 μL 蛋白酶K，混匀，55℃温育5分钟。

5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。

10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7. 重复第六步。

8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。

吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。

9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。

12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。

10. 电泳。

取3μL溶液电泳检测质量。

注：如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类，且菌种非常纯净单一，则可以用直接煮沸法。

（二）PCR扩增
1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。

27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2. PCR扩增体系：
按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR扩增体系（50μL）
3. PCR
将EP管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。

扩增程序如下为：
4. PCR
拿出EP管，从中取出5 μL反应产物，加入1 μL上样缓冲液。

点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。

电泳30 min。

在紫外灯下检测扩增结果。

（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。

否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。

1. 称量一2mL的EP管质量，记录。

2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的P管内，称量。

计算凝胶质量。

3．每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。

60℃温育至凝胶融化。

4．全部转入UNIQ-10柱中。

10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

5．加入500 μLBinding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6．加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7．再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。

吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。

8．加入30μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。

12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。

（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。

（五）序列比对
将测序的结果在NCBI上进行序列比对，根据比对结果得出鉴定菌种。

*主要仪器：
1. PCR仪（用于进行PCR扩增反应，一般国产价格在2-3万元，最低也要1.8万左右）
2.电泳仪（用于琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，一般国产几个在3000左右）
附录：实验试剂表。