染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。
两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒， 6小时后取样；
多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天， 末次染毒后24小时取样。
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2．骨髓液的制备和涂片
处死：颈椎脱臼法 处理： 取股骨，去掉血污和肌肉，用弯止血钳将骨髓
挤于预先滴有生理盐水的清洁载玻片上，混合均匀后推片
微核试验是观察受试倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
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微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
实验三、小鼠骨髓细胞微核试验
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微核(Micronucleus)的概念
微核的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单 体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色 体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单 独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质 内，因比主核小，故称微核。
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微核试验(Micronucleus test，MNT)的概念
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
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6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
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3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
用染液一3滴，染色8min，再加染液二6滴，洗耳球混 匀5min。细流水冲掉玻片染色液，晾干。
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5．观察计数
先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，再在油镜下观察 计数。 PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）桔黄色。 细胞中的微核大半呈圆形，边缘光滑，嗜色性与核质一致， 一个细胞内可以出现一个或多个微核。
因此通常计数PCE细胞中的微核。
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实验步骤
1．实验动物及处理 2．骨髓液的制备和涂片 3．固定 4．染色 5．观察计数 6. 结果分析与评价
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1．试验动物及处理
（1）动物选择：小鼠，分为五组，每组8只 （2）染毒途径：腹腔注射 （3）受试物： 环磷酰胺 （4）剂量设计：12.5、25、50、75、100 mg/kg
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注意事项：
1. 注意不要把股骨剪断 2. 挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3. 滴到玻片上的生理盐水不要太多，涂时要涂匀，
以便推片 4. 染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度
是否良好 5. 关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色
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MN（微核） NCE
正染红细胞 ( 成熟红细胞 ）
显微镜下微核观察 13