酸骆驼奶中酵母菌的分离与鉴定
酸骆驼奶是一种营养价值很高的具有浓厚民族特色的保健饮品。

本文以酸骆驼奶中酵母菌为研究对象，通过对其中的酵母菌扩大培养并且分离出较纯的菌株进行鉴定。

标签：酸骆驼奶；酵母菌；分离鉴定
1 引言
作为一种高品质的乳饮料，酸骆驼奶有着悠久的历史，我国的哈萨克族和蒙古族等民族在远古时代就有制作和饮用骆驼奶的习惯。

酸骆驼奶中营养丰富，更加适合于人体代谢。

传统的酸骆驼奶的制作方法，使其中的微生物得到了很好的保存，尤其是酵母菌的自然特性，使得酵母菌在乳制品中发挥着极其重要的作用。

自然发酵骆驼奶中含有大量的酵母菌，它与骆驼奶的生物活性和医疗保健作用密切相关，不仅能抵抗发酵过程中有害菌的污染，而且在代谢过程中能够产生抗菌物质并促进微生物B1、B2、B12等的合成。

2 试验材料
2.1 试验原料
酸骆驼奶10ml、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、牛肉膏、氯化钠、玉米粉、干麦芽酚、干酵母粉。

2.2 培养基
YEPD培养基、硝酸盐还原试验培养基、Gorodkowa琼脂培养基、醋酸盐琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基
2.3 试验仪器
生化恒温培养箱、超净工作台、灭菌锅、冰箱、电子分析天平、热空气消毒箱、双频数控超声波清洗器。

3 试验方法
菌种活化→扩大培养→初次扩培→二次扩培→收获→收集菌体→形态学鉴定→繁殖方式的观察→生化鉴定→收集数据
3.1 扩大培养
所使用的培养基为YEPD液体培养基，酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，
蒸馏水500mL，调至Ph 6.0（NaoH）。

取在零摄氏度冰箱中保存的菌液2ml加入到500mlYEPD液体培养基中活化12h，将2ml活化的菌液再加入到100ml YEPD 液体培养基中培养24h，最后将20ml菌液加入到500ml YEPD培养基中进行扩大培养。

3.2 收集菌体
配置YEPD固体培养基，即酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，蒸馏水500mL，琼脂粉10g调至Ph6.0（NaoH），并且在高压蒸汽灭菌锅121摄氏度下灭菌20min，然后将培养基倾倒到10支试管中并形成斜面。

将扩大培养的菌液在无菌实验室中接种到试管斜面上，放在29.5摄氏度的恒温箱中培养24h。

将样品用平板稀释法在沙堡弱氏培养基上于25℃培养1～3d。

挑取疑似酵母菌的单菌落，美蓝染色后做显微镜检查，确认为酵母菌的接种到沙堡弱氏斜面培养基上，纯化2～3次，置于4℃冰箱中保存。

3.3 实验方案
3.3.1 形态学鉴定（菌落形态、细胞形态、菌丝生成）
将被检菌用平板稀释法在沙堡弱氏培养基上20～25℃培养1～3d，选择单个菌落观察其颜色、形状、透明、光滑、湿润和边缘整齐等特征。

而后将被检菌接种到沙堡弱氏斜面培养基上，25℃培养24h。

美蓝染色后进行显微镜检查，观察被检菌的繁殖方式是出芽生殖或者分裂生殖。

3.3.2 酵母菌的生化鉴定
（1）不同生长条件对菌株的影响
过程：把菌种接种在相同的YEPD液体培养基上，并分装成不同的试管当中，放在不同温度的培养箱中进行培养，1号恒温箱温度为4℃，2号恒温箱温度为29℃，3号恒温箱温度为39℃，培养1～2d，取出并且观察酵母菌在试管中的生长情况；把菌种接种在不同PH和酒精度的液体培养基上，并分装成不同的试管当中，将几支试管同时置于29℃恒温箱中培养1～2d，取出并且观察酵母菌在试管中的生长情况。

（2）硝酸盐的还原实验
过程：将被检菌的生长旺盛的酵母菌接种在硝酸盐培养基中，25℃下培养1～7d，滴加甲、乙混合液（1：1），每5mL培养液加混合液0.1mL后，观察结果，呈现红色为阳性，若无红色出现，应进一步检查，向上述试验管中加少许锌粉，若出现红色，表示硝酸盐仍存在，为阴性反应（硝酸盐在醋酸的存在下，锌粉将其还原成亚硝酸盐，进一步形成芳基肼紫红色化合物）；若不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮，仍为阳性反应。

（注：甲液：将对氨基苯磺酸0.8g 溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。

乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸
溶液100mL中。

使用方法：接种后在36±1℃培养1～4d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。

硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。

）
（3）类淀粉物质生成实验
过程：将酵母菌接种到含有一种糖或一种多烃糖醇的液体培养集中，待生长以后，取一滴卢戈氏碘液滴入该试管中，然后把培养基和酵母菌一起摇动。

如果呈现蓝色，紫色或者是绿色表示该实验结果是阳性的。

卢戈氏碘液是5g碘、10g 碘化钾加水到100ml配制而成的，先用10ml水将碘和碘化钾溶解，然后再将其余的水加入摇匀。

应用时，该溶液还需再以1：5的比例稀释。

（4）糖类发酵实验
过程：本实验需要使用杜氏管，即一支约150mm×12mm的大试管中间套有一支约50mm×6mm的小试管。

在0.6%酵母浸汁中加入葡萄糖，使糖浓度达到2%，再将其分装于含杜氏管的试管中（注意使杜氏管中没有气泡）。

在115℃高压灭菌15min后，将生长旺盛的菌种接入发酵管中，25℃培养，每天观察结果。

（5）碳源同化实验
过程：将液体培养基分装在数支试管中，每支试管中的培养基是等量的。

该培养基除了用不含碳源的作为阴性对照外，都含有一种试验基质。

为了接种，试验用酵母菌适合生长的培养基上，如麦芽汁-酵母膏-葡萄糖-蛋白胨琼脂，并把生长活泼的培养物悬浮在含氮源的培养基内。

为保持培养结果稳定，通常做法就是使试管倾斜，通过暴露最大的表面来增加通气量，而且每天用手振动它，也可以放到要床上进行振动。

通常用肉眼来判别菌的生长，把阴性反应管和阳性反应管作为对照。

4 试验结果
将纯化出来的菌种进行活化培养，稀释涂布，培养48h后，观察其菌落形态，并挑取单菌落进行革兰氏染色，观察其菌体形态可以看出，此酵母菌为革兰氏阳性菌，其形态特征表现为形状轻微不规则，圆形末端的菌，通常单个，成对，小簇存在。

菌落为不规则型，圆形凸起，光滑，边缘整齐，菌落颜色为白色或乳白色。

菌细胞1-9号中：1、2号菌，椭圆形，有假菌丝形成，子囊内有圆形或椭圆形的子囊无掷孢子。

葡萄糖发酵阳性，硝酸盐还原反应阴性、类淀粉物质的生成试验阴性或阳性。

形态学、生化特性符合酵母属特性，归为酵母属。

7号菌细胞为芽殖，不形成菌丝，子囊内有1～4个孢子。

葡萄糖发酵阳性，硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验阴性。

形态学、生化特性符合有孢圆酵母属特性，归为有孢圆酵母属。

3、4、8、9号菌细胞均腊肠形。

4株菌均无有性生殖，有菌丝形成，葡萄糖发酵阳性，硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验阴性。

形态学、生化特性符合克勒克酵母属特性，归为克勒克酵母属。

参考文献
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吴跃华，男，就读于新疆石河子职业技术学院。