酵母菌的分离筛选方法酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。

菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。

含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。

1.培养基：1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO42.5g/LNa2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用）★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。

（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养用）（富集用）★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤，10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min（分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用）★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/LKH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼脂15g/L PH自然（分离纯化用）★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。

100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。

2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。

若从样品中分离特定种类时先集菌。

集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。

实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。

镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。

3.筛选：分离：取集菌液适当稀释，吸取0.1-0.2ml梯度菌液（至少两个两个平衡），涂布于马铃薯-葡萄糖麦芽汁或虎红培养基平板，也可采用混菌法或蘸取集菌菌液直接划线，（平放12h后倒置培养），25℃培养48h，低温酵母菌15℃高温酵母菌 35℃ 40℃ 45℃，形成清晰菌落。

在培养皿底划分小方格，待菌落生长良好后，用放大镜或低倍镜，观察每格内每个菌落编号并描述，颜色表面边缘切面等，再制片在高倍镜下观察各菌株的个体形态，做好记录。

选择不同菌落分别接于麦芽汁斜面，25℃培养48小时备用。

纯化：培养基与分离培养基相同，否则，不同培养基菌落会改变形态，决不能认为菌落外观相同菌属于同一种。

菌落外观相近的菌落，只能挑取一至数个菌落为代表进行纯化。

常用方法为平板划线分离法：挑取单菌落于平板划线纯化菌株，25-28℃ 2-3d，选择菌生长快菌落大典型继续纯化，每个分离物至少经两次划线，结合镜检保持菌株的纯度，对于保存菌株也应定期检查纯度。

纯化的菌株转接于麦芽汁斜面25-28℃ 2d 待鉴定或用灭菌液体石蜡封面于4℃冰箱保存。

筛选：性能测定：根据不同需要，选择不同性能测定方法。

产气性能比较：采用杜氏管发酵法，将斜面菌种两环接种于麦芽汁或豆芽汁液体培养基中（可以分两次加培养基），28℃振荡培养48h，产气时间和产气量。

产酒精能力测定：采用蒸馏法测酒精含量。

产香能力测定：通过嗅觉鉴定。

附：不同酵母菌的形态特征：酿酒酵母：在麦芽汁琼脂培养基上，菌落与细菌相似，比细菌大而厚，不透明，表面光滑，湿润粘稠，乳白色，形成假菌丝。

单细胞，形状有圆形椭圆形等，大小不一。

在麦芽汁中，沉淀表面形成环状膜。

不能利用硝酸盐。

产朊假丝酵母：在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐呈菌丝状。

细胞呈圆形椭圆形和圆柱形等。

能利用硝酸盐为氮源。

实例1：大曲中酵母菌的分离及鉴定1.富集培养：取5g样品，在试管中加入10ml麦芽汁培养基，同时加入一滴乳酸摇匀，25-28℃24h，后取1ml菌液转入另10ml麦芽汁培养基试管中培养25-28℃ 24h，稍长(过长则霉菌长出)。

培养液变浊产膜或沉淀。

观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

要求：较高的糖50g/l，抑菌剂孟加拉红0.03 g/L（许多细菌放线菌和快速生长的霉菌），PH 4.5。

或用乳酸（5ml）-马铃薯（200g）-葡萄糖（20g）培养基富集。

2.酵母菌分离：平板划线涂布或混菌均可。

取集菌菌液，梯度稀释，取10-5 10-6 10-7,0.1ml菌液涂布虎红培养基上，25-28℃ 48h（若不纯可挑取单菌落连续多次划线）。

3.酵母菌选择：对典型单菌落，经美兰染色，制片镜检，进行描述性记录，然后选择不同菌落转接于麦芽汁斜面，25-28℃ 48h备用。

4.酵母菌纯化：挑取10-7 培养基不同的单菌落，在PDA培养基接种25-28℃ 2-3d后，取形态不同的单菌落传接二次，观察菌落形态确定为单菌落后，分别接种于PDA培养基和MA培养基中，25-28℃ 3d，根据在不同培养基中菌落形态进行初步分类。

将所得菌株于斜面培养保存在4℃冰箱中。

实例2：高温堆积糟醅中酵母菌的选育1.集菌：同上 45℃ 2-3d，依此法转接2-3次，再行分离。

2.分离：梯度菌液分别涂布于麦芽汁麸皮汁豆芽汁平板于45℃2-3d，将平皿上生长的菌落划线纯化，菌株移入斜面，备用。

3.有效菌株的确认：分离的数十株酵母经镜检有酵母属的各种酵母，假丝酵母，红酵母，白地霉等。

用高粱粉糖化液，饴糖稀释液，麸皮等进行发酵，测定次生代谢产物，依次判出Y1 Y2 Y3 Y4等与酱香酒产量质量有关。

4.菌种的分类鉴定：4.1形态特征：（麦芽汁琼脂）编号形态特征Y1 菌落由白色到奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。

边缘呈波纹，凸起，色黄，中心凹，奶油色，室温放一月后，培养物由奶油色变浅褐色。

细胞呈圆卵圆椭圆，大小不等。

单个，成双，偶尔成短链，多边芽殖。

（意大利酵母）Y2菌落呈浅奶油色，菌落平滑或部分有皱纹，无光泽，边缘呈黄色，大波纹状。

细胞圆形卵形椭圆形，大小不等，多边芽殖。

(地生酵母) Y3 28℃ 3d后，细胞圆形椭圆形，单个或成双，两端芽殖，培养物奶油状，奶油色到浅褐色，平滑，稍平坦，光亮，边缘偶尔波纹，无真菌丝。

（酿酒酵母）Y4 菌落白色至奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。

培养时间偏长菌落渐硬，并呈菌丝状，不易挑起。

在麦芽汁平皿上，菌落白色，凸起，有皱纹，边缘波纹状。

细胞较小，卵圆椭圆形，有大量真菌丝。

（间型假丝酵母）4.2生理生化特征4.2.1发酵糖类：酵母菌发酵液成分分析Y1 Y2 Y3 Y4香气稍酱香，酯香稍酱香，酯香酯香醇甜香酒精（%） 3.9 3.9 4.3 5.1代谢产物乙丙丁乳异戊酸同Y1 除硫甲基丙醇乙丙丁乳酸乙醛乙酯乳酯丙醇其他成分均有乙醛丙醇异丁醇异丁醇异戊醇戊醇异戊醇硫甲基丙醇各种酵母发酵糖类结果Y1 Y2 Y3 Y4葡萄糖 + + + +D-半乳糖 + - + -麦芽糖 + - + +蔗糖 + - + +乳糖 - - - +棉子糖 - - + +蜜二糖－－－－纤维二糖－－－－海藻糖－－＋－松三糖－－－－菊糖－＋－＋可溶性淀粉－＋－＋ａ-甲基-葡萄糖苷－－－－同化碳源葡萄糖 + + + +D-半乳糖 + - + -麦芽糖 + - + +蔗糖 + - + +乳糖 + - - +棉子糖 - - + +蜜二糖－－－－山梨糖－－－－纤维二糖－－－－海藻糖－－＋－松三糖－－+ －菊糖－- －-可溶性淀粉－＋－＋ａ-甲基-葡萄糖苷－－－+卫茅醇+ －－－甘露醇－＋－＋D-木糖－- －-琥玻酸＋－－＋柠檬酸＋＋－＋各酵母菌其他生化生理特征Y1 Y2 Y3 Y4同化氮源（硝酸钾）－－－－同化乙醇＋＋－＋液化明胶－－－＋产酸试验－－＋＋产醋试验＋＋＋＋结果：Y1意大利酵母，Y2地生酵母，Y3酿酒酵母，Y4间型假丝酵母分离耐酸耐高温酵母菌选择压排底醅或双轮底糟为试样，集菌培养基中加入少量底醅浸出液。