Western Blot 实验详解
、实验材料
Western Blot 相关试剂：
甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。
4 C 保存。
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30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水
37 C
溶解，定容至100ml 。
4C 避光保存。
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10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。
分装，-20C 保存。
Western BIot 相关仪器：
电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理
经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该
技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
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2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。
25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。
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10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。
（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。
工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
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1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。
7g 去离子水溶解，用浓盐酸调至
pH8.8，定容至1L 室温 保存。
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1M Tris-HCl （pH6.8） : Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至
pH7.5，定容至1L
存。
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10X TS （洗膜液）：在 800ml 去离子水，加入 NacI 90g ， 1M Tris-HCl （pH7.5） 100ml ，
水定容至1L 。
工作液：1 X TS 室温保存。
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1M Tris-HCl （pH7.5） ： Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至
存。
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10%SDS :称取十二烷基磺酸钠（SDS ）10g,加入约80ml 去离子水，
调 pH 至 7.2，定容至 100ml 。
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1X Transfer Buffer : 在 1L 大烧杯中加入 800ml 去离子水，加入
pH7.5 ，定容至 1L 室温保
去离子
室温保 68 C 加热溶解。
用10%HCI 3.03g Trisgrams ， 14.43g
三、操作程序与结果判定 操作程序： 一）蛋白样制备 无双抗DMEM （ 10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h 后换含双抗 DMEM （ 10%血清），再过 22h 后处理细胞。
文档收集自网络，仅用于个人学习 吸出培养液，用 PBS 洗1-2次。
每个皿（60mm ）加入200-300UI 细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。
（最好处理完一个样品 后再处理另外的样品，不要同时处理 ）文档收集自网络，仅用于个人学习 用一次性 1ml 针筒吸出裂解的细胞液，注入 1.5ml 离心管中，用针筒吸打至清亮。
取 80ul 2 X Sample Buffer 混匀，37 度 30min ，沸水 10min , 1200rpm 10min 取上清， ，上样，剩余样品 -20 度储存。
文档收集自网络，仅用于个人学习 ） SDS-PAGE
制备分离胶 5ml 加入组装好的玻璃板中，立即水封。
（一般配 10%分离胶） 待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶 3ml 插入梳子，待凝固。
胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。
用针筒吹净每个孔。
上样，通电电泳：浓缩胶电压 90V （约30min ）分离胶120V （约90min ）。
三）转膜（湿转） （100KD 以上 ），小的蛋白片段建议半干转膜。
海绵，滤纸在转膜液中浸泡， PVDF 膜在甲醇中浸泡 2min 。
在玻璃板上铺海绵， 五层滤纸， 用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上， 玻璃 棒赶走气泡，贴上 PVDF 膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。
将其整体转 移到转膜夹上。
文档收集自网络，仅用于个人学习 12V 电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。
1. 2. 3. 4。
5。
冰浴， 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF 膜-五层滤纸-海绵-阳极
（四）封膜 1. 配制封膜液，在 20ml 1 X TBST 中加入 1g 脱脂奶粉（一块膜的用量） ，充分混匀倒入保 鲜盒中。
将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。
摇床上摇 2h 。
2. 3. （五） 一抗 把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇 （六） 二抗 1. 2. 4h 。
将一抗回收，放入 -20 度冰箱中。
在保鲜盒内加入 8ml 1 X TBST 摇床10min 3次。
8ml ）,摇床 2h 。
3. 倒掉冲洗液，加入二抗溶液（ （六）洗膜，显影，定影 1.
将二抗回收，放入 -20 度冰箱中。
在保鲜盒内加入 8ml 1XTBST 摇床 10min 3 次。
2. 将A 、B 液按1:1配制，在一试管中各加 400UI 的A 液和B 液。
注明：ECL A 、B 液最好选用Pierce 公司的Super Signal West Picq 国产可选用碧云天的。
文档收集自网络，仅用于个人学习 3. 在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴 ECL 混合液，将洗好的膜放上，在膜上 滴 ECL 混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。
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关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（ 压膜必须带手套，且不能有水,
否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓
）。
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将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。
用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。
结果判定
四、注意事项
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。
因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗
原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。
文档
背景过 高
问题 目的蛋 白信号 弱
转膜效 率低
显色或 曝光后 无条带
4. 5.
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形成凝胶的试剂要有足够的纯度 ,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度
,也
将影响凝胶的质量 ,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。
因此， 建议要根据不同温度 下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为
15-20 分钟最佳 ,对于浓缩胶最佳聚合时间为 8-10 分钟开始可见聚合。
灌完分离胶加水封 闭分离胶与外界氧气的结
合。
文档收集自网络，仅用于个人学习 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性 ,操作时应该戴手套口罩防护。
梳子插入浓缩胶时， 应确 保没有气泡， 可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生， 梳子拔出来时应该小心 ,不要破 坏加样孔，如有加样孔上
的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶 内。
文档收集自网络，仅用于个人学习 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品
,以减少蛋白质带的拖尾现象 。
为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 。
样品缓冲液中煮沸的样品可在 -20 C 存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。
为减少蛋白质条带的扩散 ,上样后应尽快
进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。
取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记 （如左上角 ）转膜时也应 用同样的方法对 PDVF 膜做上标记 （如左上角 ）以分清正反面和上下关系。
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10. 转膜时应依次放好 PDVF 膜与凝胶所对应的电极 ,即凝胶对应负极 ,PDVF 膜对应正极。
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9.。